兔骨髓间充质干细胞

兔骨髓间充质干细胞

运用密度梯度离心法从新西兰大白兔骨髓间充质干细胞组织中分离间充质干细胞，经预培养去除非贴壁细胞后，选用含 10% FBS 和 2 mM L-谷氨酰胺的 DMEM/F12 培养基进行扩增；通过免疫荧光染色检测 Nanog、Oct4、Sox2 等多能性标志物表达，流式细胞术分析 CD34-、CD45-、HLA-DR- 表型，并经体外诱导分化实验（成骨/成脂/成软骨）验证多向分化潜能。

产品名称：兔骨髓间充质干细胞

英文名称： Rabbit Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells

组织来源： 骨髓

默认种属 ：新西兰大白兔

产品规格：5×10^5Cells/T25

方法简介  实验室分离的兔骨髓间充质干细胞采用冲洗骨髓、密度梯度离心、差速贴壁法结合培养基筛选制备而来。

质量检测  实验室分离的兔骨髓间充质干细胞经CD90免疫荧光鉴定，纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

培养基：  兔骨髓间充质干细胞完全培养基(含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率： 每2-3天换液一次

生长特性： 贴壁

细胞形态： 成纤维细胞样

传代比例： 1:2

传代特性： 可传5代左右；3代以内状态最佳

消化液： 0.25%胰蛋白酶

兔骨髓间充质干细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

实验准备：超净工作台紫外灭菌 30min，37℃水浴预热兔骨髓间充质干细胞完全培养基、PBS 缓冲液、0.25% 胰酶‑EDTA 消化液；T25 培养瓶加入 5mL MSC 完全培养基，置于 37℃5% CO₂培养箱预平衡 15min。

冻存细胞复苏：从液氮罐取出兔骨髓间充质干细胞冻存管，投入 37℃水浴快速摇晃融化，控制融化时间 1‑2min；冻存管外壁 75% 酒精消毒，移入超净台内。

洗涤去除冻存保护剂：吸取冻存管内全部细胞悬液，滴加到装有 4mL 预热完全培养基的 15mL 离心管，轻柔吹打混匀；1000r/min 离心 5min，吸弃上清 DMSO 冻存液，保留底部细胞沉淀。

铺板接种培养：向离心管加入 2‑3mL 骨髓间充质干细胞完全培养基，温和重悬细胞沉淀；细胞悬液转移至预平衡 T25 培养瓶，十字轻柔摇晃，使细胞均匀铺于瓶底，放入培养箱静置 24h，不挪动培养瓶。

换液去除杂质：培养 24h 显微镜观察贴壁，弃去悬浮死细胞碎片以及未贴壁造血细胞，更换 5mL 新鲜完全培养基；后续每 2‑3 天更换培养基，观察梭形干细胞形态。

传代扩增操作：细胞汇合至 80%‑85% 进行传代；弃旧培养基，PBS 冲洗细胞层 2 次；加入胰酶消化液，镜下细胞变圆回缩，立刻加入完全培养基终止消化；收集细胞悬液离心，按 1:2‑1:3 比例分瓶接种扩增。

诱导分化与保藏：低代次细胞可开展成骨、成脂、成软骨诱导实验；冻存选择对数生长期细胞，离心收集沉淀，冻存液重悬分装冻存管，程序降温后液氮长期储存；严禁细胞长满，防止干性丢失、细胞衰老。

1.全程操作需在超净工作台内无菌条件下进行，任何污染风险均可能导致实验失败。

2.使用Matrigel基质胶稀释后包被培养器皿，4度过夜后37度预热使用。

3.细胞冻存后复苏需快速 thawing，37度水浴快速解冻后迅速加入预温培养基稀释DMSO。

4.补充10ug/ml胰岛素、5ug/ml转铁蛋白和2nM三碘甲腺原氨酸(T3)。

5.该细胞传代比例为1:2至1:3，每3-4天换液一次，避免过度融合影响细胞状态。