兔腹腔巨噬细胞

方法简介  实验室分离的兔腹腔巨噬细胞采用反复往腹腔注射培养基并抽取的方法结合差速贴壁制备而来。

质量检测  实验室分离的兔腹腔巨噬细胞经CD68免疫荧光鉴定，纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

培养基： 兔腹腔巨噬细胞完全培养基(含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率： 每2-3天换液一次

生长特性： 贴壁

细胞形态： 巨噬细胞样

传代比例： 不传代

传代特性： 属于终末分化细胞；属于不增殖细胞群

消化液： 利多卡因（12 mM）

兔腹腔巨噬细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

前置准备

实验动物：新西兰大白兔，采集血液或提取组织免疫细胞

试剂：Ficoll密度梯度分离液、PBS缓冲液、DMEM/F12培养基、胎牛血清(FBS)、RPIM-1640或DMEM/F12培养基、胎牛血清(FBS)

分离纯化步骤

采集实验动物全血或获取组织悬液，用PBS稀释至适当体积

缓慢叠加于Ficoll密度梯度分离液上方，室温2000rpm离心20分钟

收集界面白色单个核细胞层，用PBS洗涤2次，300g离心8分钟

用含10%FBS的RPIM-1640完全培养基重悬细胞，计数并检测活力

可采用磁珠分选法进一步富集目标免疫细胞亚群(如CD11b+巨噬细胞、CD3+T细胞等)

原代培养要点

免疫细胞多为悬浮或弱贴壁生长，使用完全培养基RPIM-1640+10%FBS+1%双抗

37度、5% CO2培养，初始接种密度建议1x10^6 cells/mL

巨噬细胞培养可添加M-CSF(20ng/mL)促进增殖和维持表型

T细胞培养需添加IL-2(10ng/mL)和抗CD3/CD28抗体刺激增殖

常见问题优化

免疫细胞活力差：操作全程保持低温，避免反复离心和吹打

细胞凋亡：培养基中添加IL-4(20ng/mL)和IL-10(10ng/mL)可抑制巨噬细胞凋亡

纯度不够：采用MACS磁珠分选可获得纯度>95%的目标免疫细胞

动物诱导与麻醉处死

新西兰兔，可腹腔注射巯基乙酸肉汤诱导巨噬细胞富集（3d）；戊巴比妥钠耳缘静脉麻醉，之后安乐处死，腹部 75% 乙醇充分消毒。

腹腔灌洗液注入

仰卧固定动物，无菌剪开腹壁，避开脏器，向腹腔注入预冷无菌 PBS / 腹腔灌洗液 100‑125 mL。

腹腔充分漂洗

轻柔按摩兔腹部 8‑10 min，使灌洗液充分冲刷腹腔内壁，洗脱腹腔巨噬细胞。

回收腹腔灌洗液

无菌抽取腹腔内液体，收集至冰上无菌离心管；可重复灌洗 1 次，合并全部灌洗液。

离心收集细胞沉淀

4℃，1500 r/min，离心 10 min；小心弃上清，得到细胞沉淀。

洗涤重悬细胞

预冷 RPMI‑1640 培养基重悬沉淀，再次离心洗涤 1‑2 次；台盼蓝染色检测细胞活率。

接种贴壁纯化

用含 10%‑20% FBS 的 RPMI‑1640 完全培养基重悬，调整细胞浓度，接种培养板 / 瓶，37 ℃、5% CO₂孵箱孵育 2‑4 h，巨噬细胞优先贴壁。

去除杂细胞获得纯化巨噬细胞

吸弃上清，PBS 冲洗 2‑3 次，洗掉未贴壁的淋巴细胞、红细胞等悬浮杂细胞，贴壁的即为兔腹腔巨噬细胞，更换完全培养基即可用于后续实验。