人椎间盘髓核细胞

方法简介  实验室分离的人椎间盘髓核细胞采用胶原酶-中性蛋白酶混合消化法并结合软骨细胞专用培养基培养筛选制备而来。

质量检测  实验室分离的人椎间盘髓核细胞，P0代经Ⅱ型胶原蛋白免疫荧光鉴定，纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

培养基： 人椎间盘髓核细胞完全培养基(含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率： 每3-4天换液一次

生长特性： 贴壁

细胞形态： 梭形、多角形

传代比例： 1:2

传代特性： 可传5代左右；3代以内状态最佳

消化液： 0.25%胰蛋白酶

人椎间盘髓核细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

前置准备

实验动物：健康成人供体，取目标组织

试剂：0.25%胰蛋白酶、I/II型胶原酶、DNase I、M199培养基、胎牛血清(FBS)、PBS缓冲液、相应专用培养基组分

分离纯化步骤

取实验动物目标组织，用预冷PBS冲洗去除血液和杂质

剪碎组织后采用胶原酶消化法(37度、1-2小时)分散细胞

过滤后300g离心8-10分钟收集细胞

根据细胞类型采用适当方法进一步纯化(密度梯度离心/免疫磁珠分选/差速贴壁)

原代培养要点

将纯化后的细胞接种于适当包被的培养皿中

使用含10%FBS的DMEM/F12完全培养基，37度、5% CO2培养

每2-3天换液一次，根据细胞生长特性调整培养条件

常见问题优化

细胞得率低：根据组织特性优化消化时间和酶浓度

细胞纯度不高：采用多种纯化方法联合使用提高纯度

细胞表型维持：控制传代次数，必要时采用特殊培养基或包被基质

冻存管 37℃水浴快速解冻，少量冰晶残留取出冻存管。

75% 酒精擦拭外壁，超净台小心转移细胞悬液至离心管。

900rpm 离心 6min，低速离心，弃上清。

髓核细胞专用完全培养基轻柔重悬，减少机械损伤。

计数，接种包被处理培养瓶。

37℃、5% CO₂培养箱静置，48h 观察细胞贴壁。

半量换液，吸出一半旧培养基，补同等体积预热新培养基，汇合 80% 传代。