人直肠癌组织源细胞

方法简介  实验室分离的癌组织源细胞采用胶原酶消化、经Percoll离心纯化制备而来。

质量检测  实验室分离的人直肠癌组织源细胞，不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

培养基： 人直肠癌组织源细胞完全培养基(含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率： 每2-3天换液一次

生长特性： 贴壁

细胞形态： 梭形、多角形

传代比例： 1:2

传代特性： 可传5代左右；3代以内状态最佳

消化液： 0.25%胰蛋白酶

人直肠癌组织源细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

前置准备

样本来源：健康成人供体，手术切除的新鲜肿瘤组织(距手术取材<2小时)

试剂：0.25%胰蛋白酶、I/II型胶原酶、DNase I、M199培养基、胎牛血清(FBS)、PBS缓冲液、DMEM/F12培养基、FBS、PBS、抗生素

分离纯化步骤

取新鲜肿瘤组织，仔细去除坏死组织和周围正常组织

将肿瘤组织剪碎至1mm3大小，加入II型胶原酶和Dispase混合消化液

37度振荡消化1-2小时(根据组织硬度调整)，期间取样检测消化效果

消化液经70um和40um滤网过滤，300g离心10分钟收集肿瘤细胞

将细胞接种于培养皿中，使用含20%FBS的完全培养基培养

原代培养要点

肿瘤细胞培养使用DMEM/F12+20%FBS+1%双抗完全培养基，37度、5% CO2

肿瘤细胞贴壁时间差异较大(24小时-7天)，需耐心观察

每2-3天换液一次，肿瘤细胞增殖较快，融合达80%时传代

原代肿瘤细胞传代3-5代后可能出现表型变化，建议尽早冻存

常见问题优化

肿瘤细胞生长缓慢：添加10ng/mL EGF和5ug/mL胰岛素可促进增殖

正常细胞污染：采用差速贴壁法或药物筛选(如5-FU)去除正常细胞

肿瘤细胞异质性：建议从同一患者多部位取材混合培养以提高代表性

冻存管 37℃水浴速融，残留微量冰晶取出。

酒精消毒管壁，超净台转移细胞悬液到离心管。

1000rpm 离心 5min，弃上清废液。

直肠癌组织源细胞完全培养基吹打重悬细胞沉淀。

计数，推荐密度接种培养瓶，十字摇匀。

37℃、5% CO₂培养箱静置，24h 镜检贴壁，观察混杂细胞。

48h 更换完全培养基去除死细胞，汇合 80% 执行传代。