人小脑颗粒细胞

方法简介  实验室分离的人小脑颗粒细胞采用胰蛋白酶消化法结合神经元专用培养基、化学试剂抑制法筛选制备而来。

质量检测  实验室分离的人小脑颗粒细胞经β-Tubulin免疫荧光鉴定，纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

包被条件： PLL（0.1 mg/mL）

培养基： 人小脑颗粒细胞完全培养基(含B-27、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率： 每2-3天换液一次

生长特性： 贴壁

细胞形态： 神经元细胞样

传代比例： 不传代

传代特性： 属于终末分化细胞；属于不增殖细胞群

消化液： 0.25%胰蛋白酶

人小脑颗粒细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

前置准备

实验动物：健康成人供体，需快速取材以保证神经元活力

试剂：0.25%胰蛋白酶、I/II型胶原酶、DNase I、M199培养基、胎牛血清(FBS)、PBS缓冲液、Neurobasal培养基、B27添加剂、NGF、BDNF、NT-3、聚赖氨酸、脑基质胶

分离纯化步骤

取实验动物目标脑区/脊髓/神经组织，用预冷无钙镁PBS仔细冲洗

在显微镜下仔细分离目标区域，去除血管和膜组织，剪碎至1mm3

用0.25%胰蛋白酶在37度消化15-20分钟，加入DNase I辅助消化

用含FBS的DMEM终止消化，移液器轻柔吹打制成单细胞悬液

经40um滤网过滤后，300g离心5分钟收集神经元细胞

原代培养要点

将神经元细胞接种于聚赖氨酸包被的盖玻片或培养皿中，使用Neurobasal+B27培养基

接种密度建议1-2x10^5 cells/cm2，37度、5% CO2、95%湿度培养

神经元培养需添加NGF(10ng/mL)、BDNF(10ng/mL)等神经营养因子

7-14天后可观察到明显的神经元突起生长，21天后形成神经网络

常见问题优化

神经元存活率低：培养基中添加GlutaMAX和丙酮酸钠可提高神经元存活率

胶质细胞过度生长：使用Ara-C(10uM)处理可抑制胶质细胞增殖

神经元突起生长不良：添加NGF、BDNF等神经营养因子，使用脑基质胶包被基底

冻存管置于 37℃水浴快速解冻，轻微震荡，剩余微量冰晶即刻取出。

酒精消毒管壁，超净台中将细胞悬液转移至预加基础培养基的无菌离心管。

800rpm 离心 6min，小心吸除上清，注意不要吸走脆弱的细胞沉淀。

加入小脑颗粒细胞专用完全培养基，轻柔吹打制备单细胞悬液，减少剪切力损伤。

细胞计数，按说明书密度接种于多聚赖氨酸包被的培养器皿，均匀铺板。

移入 37℃、5% CO₂培养箱静置培养，48h 首次观察神经元贴壁与突起生长情况。

半量换液，吸出一半旧培养基，补入同等体积预热新鲜培养基，避免全部弃液造成细胞脱落。