人小梁网细胞

方法简介  实验室分离的人小梁网细胞采用组织贴块法制备而来。

质量检测  实验室分离的人小梁网细胞经NSE（神经元特异性烯醇化酶）免疫荧光鉴定，纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

培养基： 人小梁网细胞完全培养基(含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率： 每2-3天换液一次

生长特性： 贴壁

细胞形态： 梭形、多角形

传代比例： 1:2

传代特性： 可传1-2代

消化液： 0.25%胰蛋白酶

人小梁网细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

前置准备

实验动物：健康成人供体，每只可获得2-5x10^5个内皮细胞，活力>85%

试剂：0.25%胰蛋白酶、I/II型胶原酶、DNase I、M199培养基、胎牛血清(FBS)、PBS缓冲液、兔抗细胞CD31抗体(用于流式分选)、ECM基质胶

分离纯化步骤

取实验动物目标血管/组织，用预冷PBS冲洗去除血液，仔细分离去除外膜和脂肪组织

将组织剪碎后加入0.25%胰蛋白酶，37度消化15-20分钟，收集消化液

再加入II型胶原酶，37度振荡消化45-60分钟，充分分散组织

消化液经70um和40um滤网依次过滤，300g离心10分钟收集细胞

用含CD31抗体的磁珠进行阳性/阴性分选，或采用差速贴壁法去除成纤维细胞，收集CD31+内皮细胞

原代培养要点

将纯化后的内皮细胞接种于明胶预包被的培养皿中，使用ECM基质胶包被可显著提高贴壁率

接种密度建议3x10^4 cells/cm2，37度、5% CO2培养，内皮细胞通常24-72小时贴壁

使用内皮细胞专用培养基(含20%FBS、EGF 5ng/mL、FGF 2ng/mL、肝素10ug/mL)

每2-3天换液一次，细胞融合至80-90%时可用0.05%胰蛋白酶-EDTA传代

常见问题优化

内皮细胞被成纤维细胞污染：采用差速贴壁法2-3次，或CD31磁珠分选提高纯度

内皮细胞凋亡：培养基中添加ROCK抑制剂Y-27632(10uM)可显著提高存活率

表达内皮标志物下降：传代次数控制在3代以内，冻存早期细胞以备后续使用

取出冻存细胞管，37℃水浴快速摇晃，1‑2min 完成融化，管内仅留少量冰晶。

75% 酒精擦拭冻存管外壁，移入超净台，将细胞悬液缓慢滴加到含完全培养基的离心管。

低速离心：1000rpm，5min，弃去上清废液，不要触碰底部细胞沉淀。

加入专用小梁网细胞完全培养基，轻柔吹打 3‑5 次，充分重悬细胞沉淀，避免气泡。

取少量悬液计数，按推荐接种密度接种至培养瓶 / 培养板，轻轻十字摇晃混匀细胞。

放入 37℃、5% CO₂培养箱静置培养，24h 内禁止晃动，观察细胞贴壁状态。

待细胞汇合度达到 75‑85%，进行换液或者传代处理，废弃旧培养基，补加新鲜完全培养基。