人微血管周细胞

方法简介  实验室分离的人微血管周细胞采用胶原酶-中性蛋白酶联合消化法及不锈钢网筛过滤法结合密度梯度离心法制备而来。

质量检测  实验室分离的人微血管周细胞经alpha-SMA免疫荧光鉴定，纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

培养基： 人微血管周细胞完全培养基(含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率： 每2-3天换液一次

生长特性： 贴壁

细胞形态： 成纤维细胞样

传代比例： 1:2

传代特性： 可传5代左右；3代以内状态最佳

消化液： 0.25%胰蛋白酶

人微血管周细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

前置准备

实验动物：健康成人供体，取目标组织微血管片段

试剂：0.25%胰蛋白酶、I/II型胶原酶、DNase I、M199培养基、胎牛血清(FBS)、PBS缓冲液、ECM基质胶、FBS、PBS

分离纯化步骤

取实验动物目标组织，用预冷PBS冲洗去除血液

仔细分离微血管片段，剪碎后加入II型胶原酶37度消化45-60分钟

消化液经70um和40um滤网过滤，300g离心10分钟收集细胞

采用免疫磁珠分选(抗PDGFR-beta抗体)富集周细胞

原代培养要点

周细胞使用DMEM/F12+10%FBS培养基，37度、5% CO2培养

接种于纤维连接蛋白包被的培养皿中，37度、5% CO2培养

每2-3天换液一次，细胞呈梭形贴壁生长

常见问题优化

周细胞得率低：优化微血管分离方法，提高微血管片段纯度

内皮细胞污染：采用PDGFR-beta磁珠分选提高纯度

细胞表型维持：控制传代次数，使用低浓度血清培养

冻存管取出，37℃水浴快速复融，酒精消毒冻存管外壁，转入超净台。

细胞悬液转移离心管，微血管周细胞完全培养基稀释冻存液。

1200rpm 离心 5min，弃上清，留存管底细胞沉淀。

加入周细胞完全培养基，轻柔吹打重悬细胞。

细胞计数，调整接种密度，接种培养瓶。

37℃，5% CO₂培养箱静置孵育。

24h 镜检贴壁，更换培养基去除死细胞，汇合 75‑85% 进行传代。