人外周血来源内皮祖细胞

方法简介  实验室分离的人外周血来源内皮祖细胞采用采集外周血、密度梯度离心、差速贴壁法结合内皮细胞专用培养基培养筛选制备而来。

质量检测  实验室分离的人外周血来源内皮祖细胞经CD34免疫荧光鉴定，纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

包被条件： PLL（0.1 mg/mL）或明胶（0.1%）

培养基： 人外周血来源内皮祖细胞完全培养基(含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率： 每2-3天换液一次

生长特性： 贴壁

细胞形态： 内皮细胞样

传代比例： 1:2

传代特性： 可传1-2代；不建议多次传代

消化液： 0.25%胰蛋白酶

人外周血来源内皮祖细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

前置准备

实验动物：健康成人供体，采集血液或骨髓

试剂：Ficoll密度梯度分离液、PBS缓冲液、M199培养基、胎牛血清(FBS)、内皮细胞专用培养基(ECM)、FBS

分离纯化步骤

采集实验动物外周血或骨髓，用PBS稀释后叠加于Ficoll分离液上

室温2000rpm离心20分钟，收集界面单个核细胞

用完全培养基洗涤2次后，采用免疫磁珠分选(CD34+或CD133+)富集祖细胞

原代培养要点

内皮祖细胞使用ECM培养基(含20%FBS、EGF、FGF、肝素、胰岛素)

接种于纤维连接蛋白包被的培养皿中，37度、5% CO2培养

每2-3天换液一次，5-7天后可观察到内皮样细胞长入

常见问题优化

祖细胞得率低：采集后尽快处理，避免细胞活化凋亡

内皮分化不完全：培养基中保持适当浓度的VEGF和FGF

细胞纯度不高：采用CD34+磁珠分选可获得高纯度祖细胞

冻存管取出，37℃水浴快速解冻，酒精擦拭管壁，转入超净台。

细胞悬液转移离心管，内皮祖细胞专用完全培养基稀释冻存液。

1200rpm 离心 5min，弃上清冻存液，保留细胞沉淀。

加入 EPC 完全培养基，轻柔吹打重悬细胞。

细胞计数，调整接种密度，接种包被培养瓶。

37℃，5% CO₂培养箱静置孵育。

24‑48h 镜检贴壁，更换培养基去除悬浮死细胞，观察内皮样集落，汇合后传代。