人外周血单核细胞

方法简介  实验室分离的人外周血单核细胞采用密度梯度离心法结合差速贴壁法制备而来。

质量检测  实验室分离的人外周血单核细胞经CD14免疫荧光鉴定，纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

培养基： 人外周血单核细胞完全培养基(含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率： 每2-3天换液一次

生长特性： 半贴壁半悬浮

细胞形态： 圆形、巨噬细胞样

传代比例： 不传代

传代特性： 不增殖；不传代

消化液： 0.25%胰蛋白酶

人外周血单核细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

前置准备

实验动物：健康成人供体，采集血液或提取组织免疫细胞

试剂：Ficoll密度梯度分离液、PBS缓冲液、M199培养基、胎牛血清(FBS)、RPIM-1640或DMEM/F12培养基、胎牛血清(FBS)

分离纯化步骤

采集实验动物全血或获取组织悬液，用PBS稀释至适当体积

缓慢叠加于Ficoll密度梯度分离液上方，室温2000rpm离心20分钟

收集界面白色单个核细胞层，用PBS洗涤2次，300g离心8分钟

用含10%FBS的RPIM-1640完全培养基重悬细胞，计数并检测活力

可采用磁珠分选法进一步富集目标免疫细胞亚群(如CD11b+巨噬细胞、CD3+T细胞等)

原代培养要点

免疫细胞多为悬浮或弱贴壁生长，使用完全培养基RPIM-1640+10%FBS+1%双抗

37度、5% CO2培养，初始接种密度建议1x10^6 cells/mL

巨噬细胞培养可添加M-CSF(20ng/mL)促进增殖和维持表型

T细胞培养需添加IL-2(10ng/mL)和抗CD3/CD28抗体刺激增殖

常见问题优化

免疫细胞活力差：操作全程保持低温，避免反复离心和吹打

细胞凋亡：培养基中添加IL-4(20ng/mL)和IL-10(10ng/mL)可抑制巨噬细胞凋亡

纯度不够：采用MACS磁珠分选可获得纯度>95%的目标免疫细胞

冻存管取出，37℃水浴快速复融，酒精消毒管壁，移入超净工作台。

细胞悬液转移离心管，单核细胞完全培养基稀释冻存液。

1200rpm 离心 5min，弃上清，留存细胞沉淀。

加入完全培养基，轻柔吹打重悬悬浮细胞。

细胞计数，调整接种密度，接种培养板，可诱导贴壁分化。

37℃、5% CO₂培养箱孵育。

24h 观察细胞，半量换液，根据实验开展诱导巨噬细胞分化。