人外周血单个核细胞

方法简介  实验室分离的人外周血单个核细胞采用取外周血、通过密度梯度离心法制备而来，细胞总量约为1×10⁷ cells/瓶。

质量检测  实验室分离的人外周血单个核细胞，不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

培养基： 人外周血单个核细胞完全培养基(含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率： 每2-3天换液一次

生长特性： 半贴壁半悬浮

细胞形态： 圆形

传代比例： 不传代

传代特性： 不增殖；不传代

消化液： 0.25%胰蛋白酶

人外周血单个核细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

前置准备

实验动物：健康成人供体，采集血液或提取组织免疫细胞

试剂：Ficoll密度梯度分离液、PBS缓冲液、M199培养基、胎牛血清(FBS)、RPIM-1640或DMEM/F12培养基、胎牛血清(FBS)

分离纯化步骤

采集实验动物全血或获取组织悬液，用PBS稀释至适当体积

缓慢叠加于Ficoll密度梯度分离液上方，室温2000rpm离心20分钟

收集界面白色单个核细胞层，用PBS洗涤2次，300g离心8分钟

用含10%FBS的RPIM-1640完全培养基重悬细胞，计数并检测活力

可采用磁珠分选法进一步富集目标免疫细胞亚群(如CD11b+巨噬细胞、CD3+T细胞等)

原代培养要点

免疫细胞多为悬浮或弱贴壁生长，使用完全培养基RPIM-1640+10%FBS+1%双抗

37度、5% CO2培养，初始接种密度建议1x10^6 cells/mL

巨噬细胞培养可添加M-CSF(20ng/mL)促进增殖和维持表型

T细胞培养需添加IL-2(10ng/mL)和抗CD3/CD28抗体刺激增殖

常见问题优化

免疫细胞活力差：操作全程保持低温，避免反复离心和吹打

细胞凋亡：培养基中添加IL-4(20ng/mL)和IL-10(10ng/mL)可抑制巨噬细胞凋亡

纯度不够：采用MACS磁珠分选可获得纯度>95%的目标免疫细胞

冻存管取出，37℃水浴快速解冻，酒精擦拭管壁，送入超净台。

细胞悬液转移离心管，RPMI‑1640 基础培养基稀释冻存保护剂。

1200rpm 离心 5min，弃上清，保留细胞沉淀，为悬浮细胞。

加入完全培养基，轻柔吹打重悬细胞沉淀。

细胞计数，调整细胞浓度，接种悬浮培养器皿。

37℃，5% CO₂培养箱悬浮静置培养。

24h 镜检细胞状态，半量换液，根据实验需求诱导分化或者分瓶。