人脐带血来源内皮祖细胞

方法简介  实验室分离的人脐带血来源内皮祖细胞采用密度梯度离心、差速贴壁法结合内皮细胞专用培养基培养筛选制备而来。

质量检测  实验室分离的人脐带血来源内皮祖细胞经CD34免疫荧光鉴定，纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

包被条件： PLL（0.1 mg/mL）或明胶（0.1%）

培养基： 人脐带血来源内皮祖细胞完全培养基(含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率： 每2-3天换液一次

生长特性： 贴壁

细胞形态： 内皮细胞样

传代比例： 1:2

传代特性： 可传1-2代；不建议多次传代

消化液： 0.25%胰蛋白酶

人脐带血来源内皮祖细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

前置准备

实验动物：健康成人供体，采集血液或骨髓

试剂：Ficoll密度梯度分离液、PBS缓冲液、M199培养基、胎牛血清(FBS)、内皮细胞专用培养基(ECM)、FBS

分离纯化步骤

采集实验动物外周血或骨髓，用PBS稀释后叠加于Ficoll分离液上

室温2000rpm离心20分钟，收集界面单个核细胞

用完全培养基洗涤2次后，采用免疫磁珠分选(CD34+或CD133+)富集祖细胞

原代培养要点

内皮祖细胞使用ECM培养基(含20%FBS、EGF、FGF、肝素、胰岛素)

接种于纤维连接蛋白包被的培养皿中，37度、5% CO2培养

每2-3天换液一次，5-7天后可观察到内皮样细胞长入

常见问题优化

祖细胞得率低：采集后尽快处理，避免细胞活化凋亡

内皮分化不完全：培养基中保持适当浓度的VEGF和FGF

细胞纯度不高：采用CD34+磁珠分选可获得高纯度祖细胞

单核细胞富集：通过密度梯度离心分离脐带血单个核细胞，作为内皮祖细胞初始培养原料。

纤连蛋白包被培养板：培养板提前用纤连蛋白包被，构建内皮细胞特异性贴壁基质，提升祖细胞贴壁率。

定向诱导培养：接种后加入含VEGF诱导因子的内皮祖细胞专用培养基，诱导细胞定向增殖分化。

精准周期换液：接种后第4天首次换液，去除未贴壁杂细胞，后续每2天换液一次。

克隆筛选扩增：培养7天左右出现典型内皮祖细胞克隆，筛选形态规整克隆，单独扩增培养。

功能鉴定检测：检测细胞吞噬能力、小管形成能力，验证内皮祖细胞血管生成功能。

低代冻存留存：3-5代高活性细胞冻存，避免高代细胞功能衰退，保留血管分化活性。