人原代细胞

 产品简介

人原代细胞是从人体新鲜组织经酶消化 / 组织块法分离得到，保留体内细胞生物学特征、基因表达与功能特性，无外源病毒永生化。适合体外细胞功能实验、药物筛选、毒理学、组织工程等研究；不适合长期多次传代、大量扩增实验。

重要提示：

1. 原代细胞存在供体个体差异，不同批次增殖速度、细胞活性会有区别；

2. 不建议用于基因编辑稳定株构建，细胞增殖能力弱，转染效率偏低。

培养基与配套试剂

1.*专用原代细胞培养基：基础培养基 + 细胞生长添加剂（AGS）+ 胎牛血清 + 双抗（青霉素 / 链霉素）

不要直接使用普通 DMEM、RPMI1640 完全培养基替代，会导致细胞生长停滞、凋亡。

2. 消化液：0.25% 胰蛋白酶 - EDTA

3. 终止液：含血清培养基

4. 清洗液：无菌 PBS（pH7.2~7.4）

细胞接收与复苏操作

1. 细胞接收

- 干冰运输冻存管：收到后立即转入液氮罐长期保存；短期可放 - 80℃（不超过 7 天，-80 长期存放会大幅降低活率）

- 活细胞（T25 瓶）：收到镜检，观察细胞贴壁、污染情况，静置 2~4h 稳定后再处理。

 2. 复苏步骤

1. 提前预热完全培养基（37℃水浴）；

2. 冻存管快速投入 37℃水浴，**1~2min 快速融化**，剩余一点点冰时取出；

3. 75% 酒精擦拭管壁，无菌操作转移至离心管，加入 5mL 完全培养基轻柔混匀；

4. 1000 rpm，5 min 离心；弃上清；

5. 加入新鲜完全培养基重悬细胞，接种至培养瓶；

6. 37℃、5% CO₂恒温培养箱培养；**24h 内不要移动培养瓶**，让细胞充分贴壁。

传代培养操作

汇合度达到 70%~80% 即可传代，禁止长到 100% 满瓶，原代细胞接触抑制强，密度过高容易老化。

1. 吸出旧培养基，无菌 PBS 清洗细胞 2 次；

2. 加入适量胰酶，覆盖细胞层；37℃孵育，镜下观察细胞回缩变圆；

3. 细胞变圆立刻加入等体积含血清培养基终止消化；

4. 吹打瓶壁收集细胞悬液，1000 rpm 离心 5 min；

5. 弃上清，新鲜培养基重悬，按推荐比例分瓶（一般 1:2，**不建议 1:3 及更高稀释**）；

6. 补加培养基，放回培养箱。

细胞冻存 

1. 取对数生长期、汇合度 70%~80% 的健康原代细胞；

2. 胰酶消化、离心收集细胞；

3. 细胞沉淀用**原代专用冻存液**重悬（推荐：90% FBS+10% DMSO，或商品化无血清冻存液）；

4. 分装冻存管，程序降温：4℃ 30min → -20℃ 1~2h → -80℃过夜 → 转入液氮长期保存；

 不建议直接投入液氮，骤冷会造成大量细胞死亡。

质量控制

1. 细胞活率：复苏后活率≥85%；

2. 微生物检测：细菌、真菌、支原体阴性；

3. 鉴定：免疫荧光 / 流式鉴定标志物（如内皮细胞 CD31，成纤维细胞 Vimentin）；

4. 排除：HIV、HBV、HCV 等病原体筛查（供体筛查）。

注意事项

1. **支原体防控**：原代细胞极易受支原体污染，操作环境、耗材严格无菌；定期支原体检测；

2. 血清批次影响大，固定血清批次，不要频繁更换；

3. 细胞老化特征：胞体变大、扁平、颗粒增多、增殖变慢、凋亡增加，出现老化立即弃用；

4. 仅用于体外科研，禁止临床移植、人体实验；

5. 废弃物按照 BSL-2 生物安全规范灭活处理；

6. 避免反复吹打，原代细胞比较脆弱，吹打力度轻柔。