人角膜成纤维细胞

人角膜成纤维细胞

从健康供体角膜成纤维细胞组织标本经机械分离与胶原酶 II 联合消化获取成纤维细胞，经差速贴壁法纯化后接种于纤维连接蛋白包被培养皿中，采用 DMEM/F12 完全培养基（含 10% FBS、2 mM L-谷氨酰胺及 1% 非必需氨基酸）维持培养；通过免疫荧光检测 FSP-1/S100A4、α-SMA（活化型）及 PDGFR-β 表达，Western blot 分析细胞外基质蛋白（胶原 I、纤连蛋白）分泌水平，确认成纤维细胞功能表型。

产品名称：人角膜成纤维细胞

英文名称： Human Corneal Fibroblasts

组织来源： 眼角膜组织

默认种属 ：人

产品规格：5×10^5Cells/T25

方法简介  实验室分离的人角膜成纤维细胞采用胰蛋白酶-胶原酶混合消化法结合差速贴壁法制备而来。

质量检测  实验室分离的人角膜成纤维细胞经Vimentin免疫荧光鉴定，纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

培养基： 人角膜成纤维细胞完全培养基(含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率： 每2-3天换液一次

生长特性： 贴壁

细胞形态： 成纤维细胞样

传代比例： 1:2

传代特性： 可传5代左右；3代以内状态最佳

消化液： 0.25%胰蛋白酶

人角膜成纤维细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

细胞复苏：角膜成纤维细胞属于脆弱原代细胞，复苏全程无菌低温操作。37℃水浴慢速解冻，彻底融化无冰晶残留，管壁酒精消毒后，将细胞悬液移入含角膜细胞专用培养基的离心管，1000rpm离心5min，弃上清，轻柔重悬，接种后静置48h首次观察，减少外界干扰。

细胞换液：复苏后48h首次换液，后续每72h换液一次。换液时PBS低温轻柔润洗1次，去除漂浮死细胞，加入预热恒温培养基，避免温差刺激导致细胞应激老化。全程动作轻柔，防止贴壁脆弱细胞脱落。

细胞传代：细胞融合度达95%满壁后传代，成纤维细胞接触抑制显著。弃培养基，PBS润洗2次，加入0.2%低浓度胰酶消化液，37℃消化3min，待细胞完全舒展脱壁后终止消化。离心重悬，按1:2低比例传代，保证细胞生长密度，延缓细胞老化。

细胞消化：采用低浓度温和消化体系，适配角膜细胞脆弱特性。消化前彻底清除血清残留，恒温充分消化3min，轻敲瓶壁辅助脱落。吹打力度均匀缓慢，将梭形细胞充分分散，无团块、无破损，最大程度保留细胞活性。

细胞冻存：选取形态细长、排列规整、无老化空泡的健康细胞，冻存液配比90%FBS+10%DMSO，无基础培养基添加。细胞密度调整至7×10⁵个/mL，梯度缓慢降温，液氮长期保存，有效延缓原代细胞衰老。

细胞接种：原代角膜成纤维细胞生长依赖性强，接种密度控制在9×10³个/cm²，密度过低易生长停滞。接种后缓慢摇匀，静置8h待完全贴壁，贴壁期间杜绝移动、震荡培养容器。

细胞质控：合格细胞呈细长梭形、排列整齐、折光性强，无宽大扁平老化形态，无杂质污染。细胞增殖缓慢、形态稳定，传代5代内无明显衰老，支原体、真菌、细菌检测阴性，适用于角膜损伤修复、纤维化研究。

1.取材时需迅速分离目标血管组织，用含肝素的PBS冲洗管腔去除残留血液，整个过程控制在15分钟以内。

2.使用纤维连接蛋白(10ug/ml)包被培养器皿可显著改善内皮细胞贴壁速度和铺展形态。

3.该细胞对培养条件较为敏感，建议初次培养时设置多个平行实验以提高成功率。

4.培养基中需添加10ng/ml碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和10ug/ml肝素，促进内皮细胞增殖并维持表型。

5.换液时每2天更换一次新鲜培养基，换液时动作轻柔避免冲刷已贴壁的内皮细胞单层。