人滑膜成纤维细胞

方法简介  实验室分离的人滑膜成纤维细胞采用混合酶消化结合差速贴壁法制备而来。

质量检测  实验室分离的人滑膜成纤维细胞经Vimentin免疫荧光鉴定，纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

培养基：人滑膜成纤维细胞完全培养基(含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等) 换液频率：每2-3天换液一次生长特性：贴壁细胞形态：成纤维细胞样传代比例：1:2传代特性：可传3-5代左右消化液：0.25%胰蛋白酶人滑膜成纤维细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

前置准备

实验动物：健康成人供体，取健康组织块约0.5-1g

试剂：0.25%胰蛋白酶、I/II型胶原酶、DNase I、M199培养基、胎牛血清(FBS)、PBS缓冲液、DMEM/F12完全培养基、胎牛血清(FBS)

分离纯化步骤

取实验动物目标组织，用预冷无钙镁PBS反复冲洗去除血液和杂质

剪碎组织至1mm3大小，加入0.25%胰蛋白酶，37度消化30-40分钟

加入II型胶原酶继续消化30分钟，胎牛血清终止消化

经70um和40um滤网过滤，300g离心8分钟收集细胞沉淀

重悬细胞后接种于未包被培养皿中，37度培养24小时后换液去除悬浮细胞

原代培养要点

成纤维细胞贴壁能力强，接种后12-24小时大部分细胞贴壁，呈梭形或星形

使用DMEM/F12+10%FBS完全培养基，37度、5% CO2培养

每2-3天换液一次，细胞融合达80-90%时可用0.25%胰蛋白酶消化传代

原代成纤维细胞增殖较快，通常7-14天可达融合状态

常见问题优化

成纤维细胞生长过快：适当降低FBS浓度至5-10%可减缓生长速度

细胞老化：控制传代次数在10代以内，早期代次实验结果更可靠

交叉污染：严格无菌操作，注意区分成纤维细胞与肌成纤维细胞表型

无菌取关节滑膜结缔组织，剔除软骨、骨碎片，PBS 冲洗炎性渗出物。

组织块贴壁法培养，小块滑膜组织铺瓶底干燥固定 30min。

加入低血清成纤维培养基，37℃静置 5 天不移动培养瓶。

第 5 天观察梭形成纤维细胞爬出，全换液去除漂浮组织碎块。

细胞大量增殖汇合后胰酶消化收集原代滑膜成纤维细胞。

传代培养控制密度，最多使用 P1-P5 代细胞。

给予 IL-6、TNF-α 刺激构建类风湿关节炎体外细胞模型。