人肝窦内皮细胞

方法简介  实验室分离的人肝窦内皮细胞采用混合酶灌流消化、反复低速离心、密度梯度离心法，并通过内皮细胞专用培养基培养筛选制备而来。

质量检测  实验室分离的人肝窦内皮细胞经CD31或CD14免疫荧光鉴定，纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

包被条件： PLL（0.1 mg/mL）或明胶（0.1%）

培养基： 人肝窦内皮细胞完全培养基(含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率： 每2-3天换液一次

生长特性： 贴壁

细胞形态： 内皮细胞样

传代比例： 1:2

传代特性： 可传1-2代

消化液： Accutase消化液或0.25%胰蛋白酶

人肝窦内皮细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

前置准备

实验动物：健康成人供体，每只可获得2-5x10^5个内皮细胞，活力>85%

试剂：0.25%胰蛋白酶、I/II型胶原酶、DNase I、M199培养基、胎牛血清(FBS)、PBS缓冲液、兔抗细胞CD31抗体(用于流式分选)、ECM基质胶

分离纯化步骤

取实验动物目标血管/组织，用预冷PBS冲洗去除血液，仔细分离去除外膜和脂肪组织

将组织剪碎后加入0.25%胰蛋白酶，37度消化15-20分钟，收集消化液

再加入II型胶原酶，37度振荡消化45-60分钟，充分分散组织

消化液经70um和40um滤网依次过滤，300g离心10分钟收集细胞

用含CD31抗体的磁珠进行阳性/阴性分选，或采用差速贴壁法去除成纤维细胞，收集CD31+内皮细胞

原代培养要点

将纯化后的内皮细胞接种于明胶预包被的培养皿中，使用ECM基质胶包被可显著提高贴壁率

接种密度建议3x10^4 cells/cm2，37度、5% CO2培养，内皮细胞通常24-72小时贴壁

使用内皮细胞专用培养基(含20%FBS、EGF 5ng/mL、FGF 2ng/mL、肝素10ug/mL)

每2-3天换液一次，细胞融合至80-90%时可用0.05%胰蛋白酶-EDTA传代

常见问题优化

内皮细胞被成纤维细胞污染：采用差速贴壁法2-3次，或CD31磁珠分选提高纯度

内皮细胞凋亡：培养基中添加ROCK抑制剂Y-27632(10uM)可显著提高存活率

表达内皮标志物下降：传代次数控制在3代以内，冻存早期细胞以备后续使用

无菌分离肝小叶组织，预冷缓冲液原位灌注冲洗肝窦内部血细胞。

复合胶原酶梯度消化肝脏组织，分次离心富集肝窦内皮细胞。

差速贴壁法去除肝细胞、肝星状细胞杂细胞，纯化内皮悬液。

接种胶原 Ⅳ 包被培养板，添加专用肝窦内皮细胞培养添加剂。

培养 72h 首次换液，持续去除漂浮肝细胞碎片。

细胞融合 65% 即可传代，肝窦内皮增殖速度慢，减少传代次数。

使用 CD146、vWF 标志物鉴定细胞，构建肝纤维化内皮损伤模型。