人肺大动脉平滑肌细胞

方法简介  实验室分离的人肺大动脉平滑肌细胞采用胰蛋白酶-胶原酶联合消化法结合差速贴壁法制备而来。

质量检测  实验室分离的人肺大动脉平滑肌细胞经α-SMA免疫荧光鉴定，纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

培养基： 人肺大动脉平滑肌细胞完全培养基(含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率： 每2-3天换液一次

生长特性： 贴壁

细胞形态： 成纤维细胞样

传代比例： 1:2

传代特性： 可传5代左右；3代以内状态最佳

消化液： 0.25%胰蛋白酶

人肺大动脉平滑肌细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

前置准备

实验动物：健康成人供体，组织取材需保持血管/器官完整性

试剂：0.25%胰蛋白酶、I/II型胶原酶、DNase I、M199培养基、胎牛血清(FBS)、PBS缓冲液、平滑肌细胞专用培养基、胎牛血清(FBS)

分离纯化步骤

取实验动物目标组织(血管/器官平滑肌层)，用预冷PBS反复冲洗去除血液

仔细分离去除外膜和黏膜层，仅保留平滑肌层组织，剪碎至1-2mm3

加入0.25%胰蛋白酶和II型胶原酶混合液，37度消化40-60分钟，期间振荡2-3次

消化完成后过滤(70um+40um)，300g离心10分钟收集细胞沉淀

细胞悬液接种于培养皿中，采用差速贴壁法24小时后换液去除非贴壁细胞

原代培养要点

平滑肌细胞贴壁能力较强，接种后24-48小时可见贴壁细胞呈梭形生长

使用含20%FBS的DMEM/F12完全培养基，37度、5% CO2培养

每2-3天换液一次，细胞融合达80-90%时进行传代

平滑肌细胞传代时使用0.25%胰蛋白酶消化5-10分钟，离心收集后重新接种

常见问题优化

细胞纯度不高：可采用药物筛选法(5-氟尿嘧啶20uM处理48小时去除非平滑肌细胞)

平滑肌细胞表型转换：控制传代次数在5代以内，培养基中保持适当FBS浓度(10-20%)

细胞生长缓慢：添加10ng/mL PDGF-BB可促进平滑肌细胞增殖

一、实验前准备

1. 器械灭菌：眼科剪、直弯镊、血管钳、培养皿、离心管、滤网、手术刀片高压湿热灭菌；超净台紫外照射 30min 通风备用。

2. 试剂配制：无菌 PBS（含双抗）、0.25% 胰蛋白酶 - EDTA 消化液、DMEM 高糖完全培养基（10% 胎牛血清 + 1% 青霉素链霉素）、75% 医用酒精。

3. 样本预处理耗材：冰盒盛装预冷无菌 PBS，提前分装培养基至培养瓶。

二、取材与预处理

1. 取人体肺大动脉血管组织，75% 酒精表面擦拭消毒，移入预冷含双抗 PBS 中漂洗 3 次，去除血液、筋膜及结缔组织。

2. 纵向剪开血管，用棉签轻柔刮除血管内侧内皮细胞层，剥离外层结缔组织，仅保留中间平滑肌肌层，剪碎至 1mm³ 组织碎块。

三、细胞分离与消化

1. 组织碎块转入离心管，加入 5 倍体积 0.25% 胰酶消化液，37℃水浴摇床低速消化 15min。

2. 终止消化：加入等量完全培养基中和胰酶，反复吹打 10 次打散细胞团。

3. 1000r/min 离心 5min，弃上清，沉淀用无菌 PBS 重悬洗涤一次再次离心。

四、纯化与接种培养

1. 细胞沉淀用完全培养基重悬，过 200 目细胞筛去除未消化组织残渣。

2. 接种于 T25 培养瓶，置于 37℃、5% CO₂恒温培养箱静置培养。

3. 24h 后首次换液去除未贴壁杂细胞，后续每 2~3d 更换培养基，细胞汇合 80% 即可传代。