大鼠椎间盘纤维环细胞

方法简介  实验室分离的大鼠椎间盘纤维环细胞采用胶原酶-中性蛋白酶联合消化法并结合软骨细胞专用培养基培养筛选制备而来。

质量检测  实验室分离的大鼠椎间盘纤维环细胞经Ⅰ型胶原蛋白免疫荧光鉴定，纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

培养基： 大鼠椎间盘纤维环细胞完全培养基(含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率： 每2-3天换液一次

生长特性： 贴壁

细胞形态： 梭形、多角形

传代比例： 1:2

传代特性： 可传5代左右；3代以内状态最佳

消化液： 0.25%胰蛋白酶

大鼠椎间盘纤维环细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

前置准备

实验动物：SD大鼠，取健康组织块约0.5-1g

试剂：0.25%胰蛋白酶、II型胶原酶、DNase I、DMEM/F12培养基、胎牛血清(FBS)、PBS缓冲液、DMEM/F12完全培养基、胎牛血清(FBS)

分离纯化步骤

取实验动物目标组织，用预冷无钙镁PBS反复冲洗去除血液和杂质

剪碎组织至1mm3大小，加入0.25%胰蛋白酶，37度消化30-40分钟

加入II型胶原酶继续消化30分钟，胎牛血清终止消化

经70um和40um滤网过滤，300g离心8分钟收集细胞沉淀

重悬细胞后接种于未包被培养皿中，37度培养24小时后换液去除悬浮细胞

原代培养要点

成纤维细胞贴壁能力强，接种后12-24小时大部分细胞贴壁，呈梭形或星形

使用DMEM/F12+10%FBS完全培养基，37度、5% CO2培养

每2-3天换液一次，细胞融合达80-90%时可用0.25%胰蛋白酶消化传代

原代成纤维细胞增殖较快，通常7-14天可达融合状态

常见问题优化

成纤维细胞生长过快：适当降低FBS浓度至5-10%可减缓生长速度

细胞老化：控制传代次数在10代以内，早期代次实验结果更可靠

交叉污染：严格无菌操作，注意区分成纤维细胞与肌成纤维细胞表型

分离大鼠椎间盘后，剔除髓核组织，保留外周层状纤维环组织，PBS 反复冲洗干净。

分层剥离纤维环内外侧组织，剪切成细小纤维碎块，加入 0.18%Ⅰ 型胶原酶消化液。

37℃摇床消化 65min，多次吹打松解纤维结构，释放纤维环细胞。

终止消化后筛网过滤，离心收集细胞沉淀，PBS 洗涤细胞沉淀两次。

接种于高糖 DMEM 培养基，添加维生素 C 促进细胞外基质合成，置于培养箱培养。

每 3 天换液，观察细胞呈纺锤形、层状排列生长特征，及时去除坏死细胞。

免疫染色检测 Ⅰ 型胶原表达，区分于髓核 Ⅱ 型胶原高表达特征，完成细胞鉴定。