大鼠脂肪间充质干细胞

方法简介  实验室分离的大鼠脂肪间充质干细胞采用胶原酶消化法制备而来。

质量检测  实验室分离的大鼠脂肪间充质干细胞经CD90免疫荧光鉴定，纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

培养基： 大鼠脂肪间充质干细胞完全培养基(含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率： 每2-3天换液一次

生长特性： 贴壁

细胞形态： 成纤维细胞样

传代比例： 1:2

传代特性： 可传5代左右；3代以内状态最佳

消化液： 0.25%胰蛋白酶

大鼠脂肪间充质干细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

前置准备

实验动物：SD大鼠，取材需严格无菌操作

试剂：0.25%胰蛋白酶、II型胶原酶、DNase I、DMEM/F12培养基、胎牛血清(FBS)、PBS缓冲液、MSC专用培养基/干细胞专用培养基、FBS、beta-巯基乙醇、L-谷氨酰胺

分离纯化步骤

从实验动物目标组织(骨髓/脂肪/脐带/牙髓等)中分离间充质成分

组织剪碎后经胶原酶消化(37度、2小时)，过滤获取单细胞悬液

采用密度梯度离心(Ficoll)纯化单个核细胞层

将细胞接种于培养皿中，间充质干细胞24-48小时贴壁，非贴壁细胞换液去除

贴壁细胞扩大培养至60-70%融合后，流式分选CD90+/CD105+/CD34-/CD45-细胞

原代培养要点

干细胞培养需使用专用培养基(含20%FBS的MSC培养基或DMEM/F12+20%FBS)

接种密度建议5x10^3-1x10^4 cells/cm2，37度、5% CO2培养

每2-3天换液一次，间充质干细胞呈梭形贴壁生长，融合达80%时传代

干细胞具有三系分化潜能，可在诱导培养基中向成骨/成脂/成软骨方向分化

常见问题优化

干细胞增殖缓慢：添加FGF-2(10ng/mL)和EGF(10ng/mL)可促进增殖

干细胞分化潜能下降：控制传代次数在3-5代以内，避免过度扩增

细胞纯度不高：采用流式分选CD90+/CD105+双阳性标记可提高纯度

麻醉大鼠后无菌剥离附睾周脂肪组织，置于含双抗的预冷 PBS 中浸泡 10min 抑菌。

精细分离脂肪小叶，剪切成糊状组织，加入 0.075%Ⅰ 型胶原酶 + 0.02% 透明质酸酶复合消化液。

37℃恒温摇床 120rpm 消化 60min，每隔 15min 吹打打散组织团块。

加入 DMEM 低糖完全培养基中和酶活性，依次过 70μm、40μm 细胞筛双重过滤。

1500rpm 离心 10min，弃上清，红细胞裂解液室温裂解红细胞 3min，再次离心洗涤两次。

重悬细胞接种培养，48h 后换液清除漂浮细胞，观察贴壁间充质样细胞增殖状态。

待细胞长至 90% 汇合度，进行流式检测 CD29、CD90 阳性、CD45 阴性鉴定，合格后分装冻存。