大鼠脂肪干细胞

方法简介  实验室分离的大鼠脂肪干细胞采用胶原酶消化法制备而来。

质量检测  实验室分离的大鼠脂肪干细胞经CD90免疫荧光鉴定，纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

培养基： 大鼠脂肪干细胞完全培养基(含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率： 每2-3天换液一次

生长特性： 贴壁

细胞形态： 成纤维细胞样

传代比例： 1:2

传代特性： 可传5代左右；3代以内状态最佳

消化液： 0.25%胰蛋白酶

大鼠脂肪干细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

前置准备

实验动物：SD大鼠，取材需严格无菌操作

试剂：0.25%胰蛋白酶、II型胶原酶、DNase I、DMEM/F12培养基、胎牛血清(FBS)、PBS缓冲液、MSC专用培养基/干细胞专用培养基、FBS、beta-巯基乙醇、L-谷氨酰胺

分离纯化步骤

从实验动物目标组织(骨髓/脂肪/脐带/牙髓等)中分离间充质成分

组织剪碎后经胶原酶消化(37度、2小时)，过滤获取单细胞悬液

采用密度梯度离心(Ficoll)纯化单个核细胞层

将细胞接种于培养皿中，间充质干细胞24-48小时贴壁，非贴壁细胞换液去除

贴壁细胞扩大培养至60-70%融合后，流式分选CD90+/CD105+/CD34-/CD45-细胞

原代培养要点

干细胞培养需使用专用培养基(含20%FBS的MSC培养基或DMEM/F12+20%FBS)

接种密度建议5x10^3-1x10^4 cells/cm2，37度、5% CO2培养

每2-3天换液一次，间充质干细胞呈梭形贴壁生长，融合达80%时传代

干细胞具有三系分化潜能，可在诱导培养基中向成骨/成脂/成软骨方向分化

常见问题优化

干细胞增殖缓慢：添加FGF-2(10ng/mL)和EGF(10ng/mL)可促进增殖

干细胞分化潜能下降：控制传代次数在3-5代以内，避免过度扩增

细胞纯度不高：采用流式分选CD90+/CD105+双阳性标记可提高纯度

无菌取大鼠腹股沟白色脂肪垫，剔除肉眼可见血管与筋膜，用预冷 PBS 反复冲洗 3 次去除残留血液。

将脂肪组织剪碎至 1mm³ 细小组织糜，加入 0.1%Ⅰ 型胶原酶，37℃水浴振荡消化 45min，期间每 10min 摇晃一次。

加入等量含 10% 胎牛血清的 DMEM/F12 培养基终止消化，经 100μm 细胞筛过滤组织残渣。

滤液 1200rpm 离心 8min，弃上层漂浮脂肪层与上清液，保留管底细胞沉淀。

用完全培养基重悬沉淀，接种于 T25 培养瓶，置于 37℃、5% CO₂饱和湿度培养箱培养。

培养 24h 后首次换液，去除未贴壁血细胞与杂质，后续每 3 天更换一次新鲜完全培养基。

显微镜观察细胞呈梭形旋涡状生长，细胞汇合度达 80% 时进行胰酶消化传代冻存备用。