大鼠牙龈成纤维细胞

方法简介  实验室分离的大鼠牙龈成纤维细胞采用胰蛋白酶-胶原酶混合酶消化后差速贴壁制备而来。

质量检测  实验室分离的大鼠牙龈成纤维细胞经Vimentin免疫荧光鉴定，纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

培养基： 大鼠牙龈成纤维细胞完全培养基(含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率： 每2-3天换液一次

生长特性： 贴壁

细胞形态： 成纤维细胞样

传代比例： 1:2

传代特性： 可传5代左右；3代以内状态最佳

消化液： 0.25%胰蛋白酶

大鼠牙龈成纤维细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

前置准备

实验动物：SD大鼠，取健康组织块约0.5-1g

试剂：0.25%胰蛋白酶、II型胶原酶、DNase I、DMEM/F12培养基、胎牛血清(FBS)、PBS缓冲液、DMEM/F12完全培养基、胎牛血清(FBS)

分离纯化步骤

取实验动物目标组织，用预冷无钙镁PBS反复冲洗去除血液和杂质

剪碎组织至1mm3大小，加入0.25%胰蛋白酶，37度消化30-40分钟

加入II型胶原酶继续消化30分钟，胎牛血清终止消化

经70um和40um滤网过滤，300g离心8分钟收集细胞沉淀

重悬细胞后接种于未包被培养皿中，37度培养24小时后换液去除悬浮细胞

原代培养要点

成纤维细胞贴壁能力强，接种后12-24小时大部分细胞贴壁，呈梭形或星形

使用DMEM/F12+10%FBS完全培养基，37度、5% CO2培养

每2-3天换液一次，细胞融合达80-90%时可用0.25%胰蛋白酶消化传代

原代成纤维细胞增殖较快，通常7-14天可达融合状态

常见问题优化

成纤维细胞生长过快：适当降低FBS浓度至5-10%可减缓生长速度

细胞老化：控制传代次数在10代以内，早期代次实验结果更可靠

交叉污染：严格无菌操作，注意区分成纤维细胞与肌成纤维细胞表型

取出冻存细胞管，置于 37℃水浴快速晃动复温，全程控制水浴水位不没过管盖，避免水汽渗入造成污染。

超净台内用 75% 酒精擦拭冻存管外壁，开盖后将细胞悬液缓慢转移至装有 10mL 预热完全培养基的 15mL 离心管中轻柔吹匀。

1000r/min 离心 5min，弃上清液，加入新鲜牙龈成纤维细胞专用培养基重悬细胞沉淀，吹打力度轻柔防止纤维细胞断裂。

将细胞悬液接种于 T25 培养瓶，放置 37℃、5% CO₂饱和湿度培养箱静置培养，接种后 24h 内禁止挪动培养瓶。

培养 48h 后在显微镜下观察贴壁状态，吸去未贴壁漂浮杂质与死细胞，更换全新专用培养基。

待细胞汇合度达到 85% 时，吸走旧培养基，PBS 轻柔漂洗 2 遍，加入胰酶消化液室温消化 2min，镜下见细胞回缩立刻加终止液。

离心收集传代细胞，按 1:3 比例分瓶传代；若需冻存，使用细胞冻存液重悬，程序降温盒过夜后转入液氮长期保藏。