大鼠微血管周细胞

方法简介  实验室分离的大鼠微血管周细胞采用胶原酶-中性蛋白酶联合消化法及不锈钢网筛过滤法结合密度梯度离心法制备而来。

质量检测  实验室分离的大鼠微血管周细胞经α-SMA免疫荧光鉴定，纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

包被条件： PLL（0.1 mg/mL）

培养基： 大鼠微血管周细胞完全培养基(含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率： 每2-3天换液一次

生长特性： 贴壁

细胞形态： 成纤维细胞样

传代比例： 1:2

传代特性： 可传2-3代

消化液： 0.25%胰蛋白酶

大鼠微血管周细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

前置准备

实验动物：SD大鼠，取目标组织微血管片段

试剂：0.25%胰蛋白酶、II型胶原酶、DNase I、DMEM/F12培养基、胎牛血清(FBS)、PBS缓冲液、ECM基质胶、FBS、PBS

分离纯化步骤

取实验动物目标组织，用预冷PBS冲洗去除血液

仔细分离微血管片段，剪碎后加入II型胶原酶37度消化45-60分钟

消化液经70um和40um滤网过滤，300g离心10分钟收集细胞

采用免疫磁珠分选(抗PDGFR-beta抗体)富集周细胞

原代培养要点

周细胞使用DMEM/F12+10%FBS培养基，37度、5% CO2培养

接种于纤维连接蛋白包被的培养皿中，37度、5% CO2培养

每2-3天换液一次，细胞呈梭形贴壁生长

常见问题优化

周细胞得率低：优化微血管分离方法，提高微血管片段纯度

内皮细胞污染：采用PDGFR-beta磁珠分选提高纯度

细胞表型维持：控制传代次数，使用低浓度血清培养

前期准备：多聚赖氨酸包被培养板，预热周细胞专用培养基、预冷HBSS、Ⅱ型胶原酶，无菌低温操作。

无菌取材：选取大鼠软组织微血管丰富区域，无菌剥离微血管网络，剔除大血管与结缔组织。

组织处理：剪碎微血管组织，轻柔研磨松散，漂洗去除血细胞与杂质。

酶解消化：胶原酶37℃消化14min，间断轻晃，解离微血管周细胞。

终止过滤：完全培养基终止消化，过滤去除血管残渣与组织碎片。

离心重悬：1100rpm离心5min，弃上清，周细胞专用培养基重悬细胞。

接种培养：低密度接种，静置培养48h换液，通过差速贴壁纯化周细胞，去除内皮杂细胞。