大鼠外周血中性粒细胞

方法简介  实验室分离的大鼠外周血中性粒细胞采用取外周血、通过密度梯度离心法制备而来。

质量检测  实验室分离的大鼠外周血中性粒细胞经瑞氏染色法，纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

培养基： 大鼠外周血中性粒细胞完全培养基(含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率： 每2-3天换液一次

生长特性： 悬浮

细胞形态： 圆形

传代比例： 不传代

传代特性： 不增殖；不传代

消化液： 0.25%胰蛋白酶

大鼠外周血中性粒细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

前置准备

实验动物：SD大鼠，采集血液或提取组织免疫细胞

试剂：Ficoll密度梯度分离液、PBS缓冲液、DMEM/F12培养基、胎牛血清(FBS)、RPIM-1640或DMEM/F12培养基、胎牛血清(FBS)

分离纯化步骤

采集实验动物全血或获取组织悬液，用PBS稀释至适当体积

缓慢叠加于Ficoll密度梯度分离液上方，室温2000rpm离心20分钟

收集界面白色单个核细胞层，用PBS洗涤2次，300g离心8分钟

用含10%FBS的RPIM-1640完全培养基重悬细胞，计数并检测活力

可采用磁珠分选法进一步富集目标免疫细胞亚群(如CD11b+巨噬细胞、CD3+T细胞等)

原代培养要点

免疫细胞多为悬浮或弱贴壁生长，使用完全培养基RPIM-1640+10%FBS+1%双抗

37度、5% CO2培养，初始接种密度建议1x10^6 cells/mL

巨噬细胞培养可添加M-CSF(20ng/mL)促进增殖和维持表型

T细胞培养需添加IL-2(10ng/mL)和抗CD3/CD28抗体刺激增殖

常见问题优化

免疫细胞活力差：操作全程保持低温，避免反复离心和吹打

细胞凋亡：培养基中添加IL-4(20ng/mL)和IL-10(10ng/mL)可抑制巨噬细胞凋亡

纯度不够：采用MACS磁珠分选可获得纯度>95%的目标免疫细胞

前期准备：无菌抗凝耗材、中性粒细胞专用分离液、预冷PBS、完全培养基，低温无菌避光操作。

无菌取材：无菌采集大鼠外周血，抗凝处理，轻柔混匀避免溶血。

组织处理：血液样本常温静置分层，去除上层清亮杂质，保留血细胞层。

酶解消化：无酶解步骤，采用专用梯度分离液纯化中性粒细胞。

终止过滤：离心后吸取中性粒细胞富集层，PBS充分漂洗去除杂质。

离心重悬：低速离心5min，弃上清，完全培养基温和重悬细胞。

接种培养：短期悬浮培养，定时换液去除死细胞，维持细胞生理活性。