大鼠胎盘绒毛膜滋养层细胞

方法简介  实验室分离的大鼠胎盘绒毛膜滋养层细胞采用胰蛋白酶-DNA酶联合消化法结合密度梯度离心法制备而来。

质量检测  实验室分离的大鼠胎盘绒毛膜滋养层细胞经Cytokeratin-7免疫荧光鉴定，纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

包被条件： PLL（0.1 mg/mL）

培养基： 大鼠胎盘绒毛膜滋养层细胞完全培养基(含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率： 每2-3天换液一次

生长特性： 贴壁

细胞形态： 梭形、多角形

传代比例： 1:2

传代特性： 可传1-2代

消化液： 0.25%胰蛋白酶

大鼠胎盘绒毛膜滋养层细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

前置准备

实验动物：SD大鼠，组织取材量充足，活力>85%

试剂：0.25%胰蛋白酶、II型胶原酶、DNase I、DMEM/F12培养基、胎牛血清(FBS)、PBS缓冲液

分离纯化步骤

取实验动物目标组织，用预冷无钙镁PBS反复冲洗去除血液和杂质，剪碎至1mm3大小

加入0.25%胰蛋白酶和II型胶原酶混合消化液，37度消化30-40分钟，期间振荡2-3次

消化完成后加入含20%胎牛血清的完全培养基终止消化，用移液器反复吹打分散

依次过70um、40um细胞滤网过滤，300g离心8分钟收集细胞沉淀

用完全培养基重悬细胞，计数并检测活力，调整细胞密度后进行接种

原代培养要点

调整细胞密度至5x10^4-1x10^5 cells/cm2接种于胶原包被培养皿，37度、5% CO2培养

上皮细胞贴壁较慢，通常需24-48小时方可观察到贴壁细胞，建议48小时首次换液

培养基每2-3天更换一次，使用含10% FBS的DMEM/F12完全培养基

细胞融合达80-90%时可进行传代，建议采用温和的胰蛋白酶-EDTA(0.05%)消化传代

常见问题优化

细胞贴壁率低：使用多聚赖氨酸或胶原预包被培养皿表面，可显著提高贴壁效率

上皮细胞生长缓慢：培养基中添加0.1mM IBMX和5ug/mL胰岛素，可促进上皮细胞增殖

交叉污染：严格无菌操作，培养基中添加双抗(100U/mL青霉素+100ug/mL链霉素)

前期准备：明胶包被培养板，预热滋养层专用培养基、预冷HBSS、复合消化酶，无菌低温避光操作。

无菌取材：无菌分离大鼠胎盘绒毛膜组织，剔除基底膜、血管及结缔组织，保留纯净绒毛膜组织，预冷漂洗。

组织处理：剪碎绒毛膜组织为细小碎片，轻柔吹打松散，去除残留血块与杂质。

酶解消化：复合酶液37℃消化18min，间断轻晃，解离绒毛膜滋养层细胞。

终止过滤：完全培养基终止消化，过滤去除绒毛组织残渣，收集细胞悬液。

离心重悬：1200rpm离心5min，弃上清，滋养层专用培养基重悬细胞。

接种培养：均匀接种，静置培养24h换液，后续每2d换液，纯化滋养层细胞，去除间充质杂细胞。