大鼠视网膜神经节细胞

方法简介  实验室分离的大鼠视网膜神经节细胞采用胰蛋白酶-胶原酶联合消化法，结合视网膜神经节细胞专用培养基培养和化学试剂抑制法筛选制备而来。

质量检测  实验室分离的大鼠视网膜神经节细胞经CD90免疫荧光鉴定，纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

包被条件： PLL（0.1 mg/mL）

培养基： 大鼠视网膜神经节细胞完全培养基(基础培养基，含FBS、B-27 Supplement、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率： 每2-3天换液一次

生长特性： 贴壁

细胞形态： 神经元细胞样

传代比例： 不传代

传代特性： 属于终末分化细胞；属于不增殖细胞群

消化液： 0.25%胰蛋白酶

大鼠视网膜神经节细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

前置准备

实验动物：SD大鼠，取目标组织

试剂：0.25%胰蛋白酶、II型胶原酶、DNase I、DMEM/F12培养基、胎牛血清(FBS)、PBS缓冲液、相应专用培养基组分

分离纯化步骤

取实验动物目标组织，用预冷PBS冲洗去除血液和杂质

剪碎组织后采用胶原酶消化法(37度、1-2小时)分散细胞

过滤后300g离心8-10分钟收集细胞

根据细胞类型采用适当方法进一步纯化(密度梯度离心/免疫磁珠分选/差速贴壁)

原代培养要点

将纯化后的细胞接种于适当包被的培养皿中

使用含10%FBS的DMEM/F12完全培养基，37度、5% CO2培养

每2-3天换液一次，根据细胞生长特性调整培养条件

常见问题优化

细胞得率低：根据组织特性优化消化时间和酶浓度

细胞纯度不高：采用多种纯化方法联合使用提高纯度

细胞表型维持：控制传代次数，必要时采用特殊培养基或包被基质

前期准备：多聚赖氨酸包被培养板，预热神经元专用培养基、预冷HBSS、木瓜蛋白酶，无菌低温避光操作。

无菌取材：无菌剥离大鼠视网膜完整神经层，剔除色素上皮、血管及玻璃体，预冷HBSS低温漂洗去污。

组织处理：冰上精细剪碎视网膜组织，轻柔松散组织，保护神经节细胞完整性。

酶解消化：木瓜蛋白酶37℃温和消化14min，间断轻柔吹打，解离神经节细胞。

终止过滤：神经元完全培养基终止消化，过滤去除组织残渣，收集神经细胞悬液。

离心重悬：1000rpm低速离心5min，弃上清，神经专用培养基轻柔重悬细胞。

接种培养：适宜密度接种，静置培养48h不扰动，2d后半量换液，维持神经节细胞存活与形态。