大鼠肾足突细胞

方法简介  实验室分离的大鼠肾足突细胞采用机械研磨过不同孔径不锈钢网筛结合胶原酶消化法制备而来。

质量检测  实验室分离的大鼠肾足突细胞经PCK免疫荧光鉴定，纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

包被条件： 鼠尾胶原Ⅰ（2-5 μg/cm²）

培养基： 大鼠肾足突细胞完全培养基(含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率： 每2-3天换液一次

生长特性： 贴壁

细胞形态： 上皮细胞样

传代比例： 1:2

传代特性： 可传1-2代

消化液： 0.25%胰蛋白酶

大鼠肾足突细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

前置准备

实验动物：SD大鼠，取肝脏组织约2-3g

试剂：0.25%胰蛋白酶、II型胶原酶、DNase I、DMEM/F12培养基、胎牛血清(FBS)、PBS缓冲液、William E培养基/KSOM培养基、FBS、PBS、肝素

分离纯化步骤

取实验动物肝脏组织，通过门静脉灌注0.25%胰蛋白酶(37度、20分钟)

取出肝脏，剪碎后加入II型胶原酶37度振荡消化45-60分钟

消化液经70um和40um滤网过滤，100g离心5分钟收集肝细胞

采用Percoll不连续密度梯度离心(30%/60%)纯化肝细胞

原代培养要点

肝细胞：使用William E培养基+10%FBS+100nM地塞米松+10ug/mL胰岛素

肝细胞接种后4-6小时开始贴壁，24小时内形成典型多角形上皮样细胞

肝细胞培养3-7天后功能逐渐下降，建议实验在培养7天内完成

肝星状细胞：使用DMEM/F12+10%FBS培养，细胞呈成纤维细胞样生长

常见问题优化

肝细胞活力差：灌注压力控制在10-12mmHg，消化时间严格控制

肝细胞功能丧失：培养基中添加HGF(10ng/mL)和EGF(10ng/mL)可维持肝细胞功能

肝星状细胞活化：传代后细胞逐渐活化，建议冻存早期细胞

前期准备：多聚赖氨酸包被培养板过夜，预热足突细胞专用培养基、预冷HBSS、复合胶原酶，备好精细过滤筛，无菌低温操作。

无菌取材：选取新生大鼠，无菌剥离肾皮质，精准剔除髓质、血管及结缔组织，预冷HBSS低温漂洗去污。

组织处理：低温剪碎皮质组织，精细研磨富集肾小球，彻底去除肾小管及间质杂质，纯化肾小球样本。

酶解消化：复合胶原酶37℃消化20min，间断轻柔吹打，促使肾小球足突细胞充分解离脱落。

终止过滤：足突细胞专用培养基终止消化，轻柔吹打后过滤，去除组织残渣与杂细胞团块。

离心重悬：1000rpm低速离心5min，谨慎弃上清，温和重悬细胞沉淀，保护脆弱足突细胞。

接种培养：低密度接种，培养箱静置48h不扰动，2d后半量换液，后续规律换液，维持足突细胞形态与活性。