大鼠肾小球内皮细胞

方法简介  实验室分离的大鼠肾小球内皮细胞采用先机械研磨过不锈钢网筛分离得到肾小球、后用胶原酶消化，结合内皮细胞专用培养基培养筛选制备而来。

质量检测  实验室分离的大鼠肾小球内皮细胞经CD31免疫荧光鉴定，纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

包被条件： PLL（0.1 mg/mL）或明胶（0.1%）

培养基： 大鼠肾小球内皮细胞完全培养基(含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率： 每2-3天换液一次

生长特性： 贴壁

细胞形态： 内皮细胞样

传代比例： 1:2

传代特性： 可传2-3代

消化液： 0.25%胰蛋白酶

大鼠肾小球内皮细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

前置准备

实验动物：SD大鼠，每只可获得2-5x10^5个内皮细胞，活力>85%

试剂：0.25%胰蛋白酶、II型胶原酶、DNase I、DMEM/F12培养基、胎牛血清(FBS)、PBS缓冲液、兔抗细胞CD31抗体(用于流式分选)、ECM基质胶

分离纯化步骤

取实验动物目标血管/组织，用预冷PBS冲洗去除血液，仔细分离去除外膜和脂肪组织

将组织剪碎后加入0.25%胰蛋白酶，37度消化15-20分钟，收集消化液

再加入II型胶原酶，37度振荡消化45-60分钟，充分分散组织

消化液经70um和40um滤网依次过滤，300g离心10分钟收集细胞

用含CD31抗体的磁珠进行阳性/阴性分选，或采用差速贴壁法去除成纤维细胞，收集CD31+内皮细胞

原代培养要点

将纯化后的内皮细胞接种于明胶预包被的培养皿中，使用ECM基质胶包被可显著提高贴壁率

接种密度建议3x10^4 cells/cm2，37度、5% CO2培养，内皮细胞通常24-72小时贴壁

使用内皮细胞专用培养基(含20%FBS、EGF 5ng/mL、FGF 2ng/mL、肝素10ug/mL)

每2-3天换液一次，细胞融合至80-90%时可用0.05%胰蛋白酶-EDTA传代

常见问题优化

内皮细胞被成纤维细胞污染：采用差速贴壁法2-3次，或CD31磁珠分选提高纯度

内皮细胞凋亡：培养基中添加ROCK抑制剂Y-27632(10uM)可显著提高存活率

表达内皮标志物下降：传代次数控制在3代以内，冻存早期细胞以备后续使用

前期准备：多聚赖氨酸包被培养板，预热内皮细胞专用培养基、预冷无菌PBS、Ⅱ型胶原酶，备好40μm、70μm双层细胞筛，无菌低温操作。

无菌取材：无菌摘取大鼠肾脏，剥离肾皮质，剔除髓质组织，预冷PBS反复漂洗，去除表面血污与多余结缔组织。

组织处理：剪碎皮质组织，轻柔研磨过70μm筛网，保留筛上肾小球组织，PBS漂洗筛网收集纯净肾小球结构。

酶解消化：收集肾小球组织，加入Ⅱ型胶原酶37℃消化18–20min，间断轻晃，使肾小球内皮细胞充分解离。

终止过滤：内皮完全培养基终止消化，轻柔吹打，经40μm筛过滤，去除肾小球囊壁残渣，收集内皮细胞悬液。

离心重悬：1000rpm低速离心5min，弃上清，用内皮专用培养基温和重悬细胞沉淀。

接种培养：均匀接种细胞，培养箱静置48h不移动，2d后半量换液，去除杂细胞，培养至细胞融合成型。