大鼠肾上腺皮质细胞

方法简介  实验室分离的大鼠肾上腺皮质细胞采用胶原酶消化法制备而来。

质量检测  实验室分离的大鼠肾上腺皮质细胞经3β-HSD免疫荧光鉴定，纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

包被条件： 鼠尾胶原Ⅰ（2-5 μg/cm²）

培养基： 大鼠肾上腺皮质细胞完全培养基(含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率： 每2-3天换液一次

生长特性： 贴壁

细胞形态： 梭形、多角形

传代比例： 1:2

传代特性： 可传1-3代左右；2代以内状态最佳

消化液： 0.25%胰蛋白酶

大鼠肾上腺皮质细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

前置准备

实验动物：SD大鼠，取胰腺/睾丸/肾上腺等内分泌腺体

试剂：0.25%胰蛋白酶、II型胶原酶、DNase I、DMEM/F12培养基、胎牛血清(FBS)、PBS缓冲液、DMEM/F12培养基、FBS、PBS

分离纯化步骤

取实验动物目标内分泌腺体组织，仔细去除周围结缔组织

剪碎组织后采用胶原酶消化法(37度、45-60分钟)分散细胞

经滤网过滤后，采用密度梯度离心纯化目标细胞

胰岛细胞可采用Handy solution差速沉淀法进一步纯化

原代培养要点

胰岛beta细胞：使用CMRL-1640+10%FBS+10mM HEPES+50uM beta-巯基乙醇

睾丸间质细胞：使用DMEM/F12+10%FBS+0.1% BSA培养

肾上腺皮质细胞：使用DMEM/F12+5%FBS+0.1uM地塞米松培养

常见问题优化

胰岛细胞纯度不高：采用Handy solution梯度离心可获得纯度>90%的胰岛细胞

内分泌细胞功能维持：添加相应激素(如IGF-1、IGF-2)可维持细胞功能

细胞存活率低：培养基中添加抗坏血酸和转铁蛋白可提高存活率

前期准备：提前用无菌明胶包被培养板，37℃静置过夜备用；预热肾上皮专用完全培养基、无菌HBSS、0.25%胰蛋白酶，备好无菌解剖器械、70μm细胞筛，全程无菌超净台操作。

无菌取材：选取新生1–3d大鼠，75%乙醇全身消毒，无菌剥离双侧肾脏，剔除肾脏包膜、血管及髓质组织，仅保留完整肾皮质组织，移入预冷无菌HBSS中漂洗去除血污。

组织处理：将肾皮质转移至无菌培养皿，剪碎至1mm³均匀组织块，反复HBSS漂洗2–3次，彻底去除残留血细胞、杂质及松散结缔组织。

酶解消化：加入足量0.25%胰蛋白酶覆盖组织块，37℃恒温水浴消化10–12min，每3min轻柔晃动一次，至组织块松散、边缘絮状脱落即可。

终止过滤：加入等量含血清完全培养基终止消化，轻柔反复吹打组织悬液，经70μm无菌细胞筛过滤，去除未消化的组织残渣与团块。

离心重悬：1000rpm低速离心5min，谨慎弃上清，避免丢失细腻细胞沉淀，用新鲜完全培养基轻柔重悬细胞，避免气泡产生。

接种培养：调整细胞密度后接种，置于恒温培养箱静置培养；48h内禁止移动培养板，2d后半量换液，清除死细胞与杂细胞，维持细胞纯度。