大鼠神经星形胶质细胞

方法简介  实验室分离的大鼠神经星形胶质细胞采用酶消化法结合差速贴壁法制备而来。

质量检测  实验室分离的大鼠神经星形胶质细胞经GFAP免疫荧光鉴定，纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

培养基： 大鼠神经星形胶质细胞完全培养基(含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率： 每2-3天换液一次

生长特性： 贴壁

细胞形态： 梭形、多角形

传代比例： 1:2

传代特性： 可传5代左右；3代以内状态最佳

消化液： 0.25%胰蛋白酶

大鼠神经星形胶质细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

前置准备

实验动物：SD大鼠，取脑组织或脊髓组织

试剂：0.25%胰蛋白酶、II型胶原酶、DNase I、DMEM/F12培养基、胎牛血清(FBS)、PBS缓冲液、DMEM/F12培养基、FBS、EGF、FGF-b、PDGF-AA

分离纯化步骤

取实验动物脑组织或脊髓组织，用预冷PBS冲洗去除血液

去除脑膜和血管组织，将目标区域剪碎至1mm3

用0.25%胰蛋白酶消化20分钟，再加入II型胶原酶消化30分钟

过滤后300g离心8分钟收集细胞，重悬于含EGF和FGF-b的培养基中

采用磁珠分选或差速培养法富集目标胶质细胞类型

原代培养要点

胶质细胞(星形胶质细胞/少突胶质细胞/小胶质细胞)培养条件略有差异

星形胶质细胞：DMEM/F12+10%FBS，37度、5% CO2，细胞呈多角形贴壁生长

少突胶质细胞：需PDGF-AA维持增殖，分化期添加T3、甲状腺素促进成熟

小胶质细胞：采用振荡分选法从混合胶质细胞中分离，悬浮或弱贴壁生长

常见问题优化

胶质细胞交叉污染：采用免疫磁珠分选可提高纯度至90%以上

少突胶质细胞分化率低：添加C57条件培养基或IBMX可促进少突胶质细胞成熟

小胶质细胞活化：避免过度培养，原代培养5代以内保持静息态表型

实验准备：配制星形胶质细胞完全培养基，提前包被培养板，备好无菌冰上耗材，选取新生大鼠大脑皮层组织。

无菌取材：冰上无菌剥离大鼠大脑皮层，彻底撕掉脑膜与血管，预冷缓冲液漂洗干净杂质。

组织处理：剪碎皮层组织，轻柔吹打松散，去除神经纤维残渣，富集胶质细胞组织。

酶解消化：0.25%胰酶37℃消化20min，间断震荡，充分解离星形胶质细胞。

纯化离心：血清终止消化，筛网过滤除渣，1200rpm离心5min，收集胶质细胞沉淀。

接种培养：完全培养基重悬细胞，均匀接种，恒温培养箱静置贴壁生长。

常规养护：24h首次换液，每3天换液一次，震荡去除杂细胞，培养至90%汇合可纯化传代。