大鼠软骨细胞

方法简介  实验室分离的大鼠软骨细胞采用胶原酶-中性蛋白酶联合消化制备而来。

质量检测  实验室分离的大鼠软骨细胞，P0代经Ⅱ型胶原蛋白免疫荧光鉴定，纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

培养基： 大鼠软骨细胞完全培养基(含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率： 每3-4天换液一次

生长特性： 贴壁

细胞形态： 梭形、多角形

传代比例： 1:2

传代特性： 可传5代左右；3代以内状态最佳

消化液： 0.25%胰蛋白酶

大鼠软骨细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

前置准备

实验动物：SD大鼠，取胫骨/股骨/关节软骨等组织

试剂：0.25%胰蛋白酶、II型胶原酶、DNase I、DMEM/F12培养基、胎牛血清(FBS)、PBS缓冲液、DMEM/F12培养基、FBS、PBS

分离纯化步骤

取实验动物目标骨组织或软骨组织，仔细去除软组织包膜

骨组织：剪碎后用0.25%胰蛋白酶消化20分钟，再加入II型胶原酶消化60-90分钟

软骨组织：剪碎后直接用II型胶原酶37度振荡消化4-6小时

消化液经70um和40um滤网过滤，400g离心10分钟收集细胞

原代培养要点

成骨细胞：使用DMEM+10%FBS培养基，37度、5% CO2培养，细胞呈多角形贴壁

软骨细胞：使用DMEM/F12+10%FBS+10ng/mL TGF-beta3培养基，可悬浮或三维培养

成骨细胞培养14-21天后可检测到ALP活性和矿化结节形成

软骨细胞传代后易去分化，建议采用低传代次数(2-3代)或三维球状培养维持表型

常见问题优化

骨细胞得率低：延长胶原酶消化时间至90分钟，或采用两次消化法

软骨细胞去分化：采用高浓度悬浮培养(1x10^5 cells/mL)维持软骨表型

成骨细胞污染：采用差速贴壁法或免疫磁珠分选提高成骨细胞纯度

实验准备：配制软骨细胞完全培养基，准备II型胶原酶、无菌器械，提前包被培养板，选取大鼠关节软骨组织。

无菌取材：无菌剥离大鼠四肢关节透明软骨，剔除骨组织、滑膜及结缔组织，预冷PBS充分漂洗。

组织处理：将透明软骨剪切成极细碎组织块，最大限度暴露软骨基质，提升酶解效率。

酶解消化：高活性II型胶原酶37℃摇床消化45min，低速持续震荡，充分解离软骨细胞。

纯化离心：血清培养基终止消化，过滤去除软骨残渣，1200rpm离心5min，收集软骨细胞沉淀。

接种培养：软骨专用培养基轻柔重悬，调整密度接种，恒温避光静置培养。

常规养护：72h首次换液减少细胞应激，每3天换液一次，防止细胞去分化，维持软骨细胞特性。