大鼠前脂肪细胞

方法简介  实验室分离的大鼠前脂肪细胞采用胶原酶消化法制备而来。

质量检测  实验室分离的大鼠前脂肪细胞经成脂诱导功能验证，诱导成脂后，经油红O定性检测阳性，成脂染色数占比>60%，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

培养基： 大鼠前脂肪细胞完全培养基(含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率： 每2-3天换液一次

生长特性： 贴壁

细胞形态： 成纤维细胞样

传代比例： 1:2

传代特性： 可传5代左右；3代以内状态最佳

消化液： 0.25%胰蛋白酶

大鼠前脂肪细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

前置准备

实验动物：SD大鼠，取皮下脂肪或棕色脂肪组织

试剂：0.25%胰蛋白酶、II型胶原酶、DNase I、DMEM/F12培养基、胎牛血清(FBS)、PBS缓冲液、DMEM/F12培养基、FBS、PBS、IBMX、地塞米松、胰岛素

分离纯化步骤

取实验动物脂肪组织，剪碎后加入II型胶原酶(1mg/mL)37度振荡消化1-2小时

消化液经70um滤网过滤，100g离心10分钟收集沉渣(含前脂肪细胞和脂肪细胞)

去除上层脂肪层，将沉渣重悬于PBS中，再次离心纯化

沉淀细胞接种于培养皿中，贴壁细胞即为前脂肪细胞/脂肪间充质干细胞

原代培养要点

前脂肪细胞使用DMEM/F12+10%FBS培养基，37度、5% CO2培养

细胞呈梭形贴壁生长，融合达80-90%时传代

诱导分化：换用分化培养基(DMEM+10%FBS+0.5mM IBMX+1uM地塞米松+10ug/mL胰岛素)诱导48-72小时后换维持培养基

脂肪细胞培养7-14天后可观察到明显脂滴积累，Oil Red O染色阳性

常见问题优化

前脂肪细胞得率低：延长胶原酶消化时间至2小时，适当提高酶浓度

分化效率低：确保诱导培养基中各组分新鲜配制，IBMX需现用现配

细胞老化：控制传代次数在5代以内，早期代次分化潜能更佳

实验准备：配制前脂肪细胞专用完全培养基，准备无菌器械、预冷缓冲液，选取大鼠腹股沟白色脂肪组织。

无菌取材：无菌剥离大鼠腹股沟脂肪垫，剔除血管、筋膜及坏死脂肪组织，预冷PBS快速漂洗。

组织处理：充分剪碎脂肪组织，去除肉眼可见杂质，尽量破碎脂肪小叶结构。

酶解消化：I型胶原酶37℃水浴消化30min，持续轻柔震荡，充分解离基质中的前脂肪细胞。

纯化离心：血清终止消化，过滤去除脂肪残渣，1200rpm离心6min，弃上层油脂收集细胞沉淀。

接种培养：完全培养基重悬细胞，调整密度接种，恒温培养箱静置贴壁培养。

常规养护：24h换液去除悬浮脂滴与死细胞，每2天换液一次，汇合后可诱导脂肪分化实验。