大鼠浦肯野细胞

方法简介  实验室分离的大鼠浦肯野细胞采用胰蛋白酶消化法结合神经元专用培养基、化学试剂抑制法筛选制备而来。

质量检测  实验室分离的大鼠浦肯野细胞经Neph3免疫荧光鉴定，纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

包被条件： PLL（0.1 mg/mL）

培养基： 大鼠浦肯野细胞完全培养基(含脂质浓缩液、BSA、Monothioglycerol、Transferrin、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率： 每2-3天换液一次

生长特性： 贴壁

细胞形态： 神经元细胞样

传代比例： 不传代

传代特性： 不增殖；不传代

消化液： 0.25%胰蛋白酶

大鼠浦肯野细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

前置准备

实验动物：SD大鼠，需快速取材以保证神经元活力

试剂：0.25%胰蛋白酶、II型胶原酶、DNase I、DMEM/F12培养基、胎牛血清(FBS)、PBS缓冲液、Neurobasal培养基、B27添加剂、NGF、BDNF、NT-3、聚赖氨酸、脑基质胶

分离纯化步骤

取实验动物目标脑区/脊髓/神经组织，用预冷无钙镁PBS仔细冲洗

在显微镜下仔细分离目标区域，去除血管和膜组织，剪碎至1mm3

用0.25%胰蛋白酶在37度消化15-20分钟，加入DNase I辅助消化

用含FBS的DMEM终止消化，移液器轻柔吹打制成单细胞悬液

经40um滤网过滤后，300g离心5分钟收集神经元细胞

原代培养要点

将神经元细胞接种于聚赖氨酸包被的盖玻片或培养皿中，使用Neurobasal+B27培养基

接种密度建议1-2x10^5 cells/cm2，37度、5% CO2、95%湿度培养

神经元培养需添加NGF(10ng/mL)、BDNF(10ng/mL)等神经营养因子

7-14天后可观察到明显的神经元突起生长，21天后形成神经网络

常见问题优化

神经元存活率低：培养基中添加GlutaMAX和丙酮酸钠可提高神经元存活率

胶质细胞过度生长：使用Ara-C(10uM)处理可抑制胶质细胞增殖

神经元突起生长不良：添加NGF、BDNF等神经营养因子，使用脑基质胶包被基底

选取出生 0–2d 乳鼠无菌断头取脑，冰上剥离完整小脑，预冷 HBSS 反复漂洗去除表面血渍。

小心剥离小脑软脑膜与表层血管，将小脑组织剪碎为细小组织颗粒，加入 0.25% 胰酶 37℃消化 12min。

加含血清培养基终止消化，轻柔吹打制备单细胞悬液，经细胞筛过滤去除未消化组织团块。

采用 Percoll 密度梯度离心分层富集浦肯野细胞，吸取目标细胞层并用神经元培养基洗涤离心。

将纯化细胞接种于提前用多聚赖氨酸包被的培养皿 / 板，加入浦肯野专用神经元培养基。

培养 24h 后添加抑制胶质增殖试剂，每 2–3d 半量换液，避免全量换液引发细胞凋亡。

培养 7–10d 细胞成熟，可开展免疫荧光（Calbindin 标记）、电生理记录、给药造模实验。