鼠疫耶尔森菌（鼠疫杆菌）核酸检测试剂盒（荧光PCR法）

【产品名称】

通用名称：鼠疫耶尔森菌（鼠疫杆菌）核酸检测试剂盒（荧光PCR法）

英文名称：Yersinia pestis (Y. pestis) nucleic acid detection kit (fluorescence PCR method)

【包装规格】 50 T/盒

【产品用途】

适用于血液、淋巴结穿刺液、痰液及咽拭子等样本中鼠疫耶尔森菌核酸的检测。

【产品简介】

鼠疫的病原体是鼠疫耶尔森菌，一种革兰氏阴性短杆菌。它在自然界中以"鼠—蚤—鼠"的循环长期存在，野生啮齿动物是主要宿主。人类感染鼠疫，最常见途径是被带菌跳蚤叮咬，接触或剥食染疫动物也可感染，而肺鼠疫患者则可通过咳嗽飞沫在人与人之间传播，引发快速扩散。由于人群普遍易感，鼠疫一旦在人间流行，传播速度和控制难度都远超一般传染病。鼠疫检测针对的病原菌是鼠疫耶尔森菌（Yersinia pestis），旧称鼠疫杆菌，是引起鼠疫这种甲类传染病的唯一病原体。

本试剂盒以鼠疫耶尔森菌（Yersinia pestis）pla基因基因保守区段为检测靶标设计引物探针，采用FAM单通道 TaqMan 探针法进行实时荧光PCR检测。Taq DNA聚合酶采用抗体修饰，室温避光条件下，可保证PCR 混样完成72小时后进行PCR 反应荧光信号依然稳定，满足批量检测的需要。PCR反应液中含有heat-labile uracil-DNA glycosylase (UNG) 和 dUTP，不耐热尿嘧啶DNA糖基化酶可以降解携带的PCR产物，在室温下是活跃的，在95℃预变性段完全失活，有助于防止下游污染和可能的假阳性。添加抗PCR抑制物因子，使本试剂盒更适用于复杂的动物临床样本的检测。考虑加样损失，本试剂盒提供55次反应的装量。

【产品内容】

【贮存及有效期】

-20℃以下避光贮存，有效期为12个月。

【注意事项】

（1）各试剂组分在使用前均需充分融化，上下颠倒混匀，请勿涡旋以免产生过多气泡，轻微离心后再开盖使用。

（2）病毒病料操作前必须做好个人防护，接触病料的物品应合理处置，以免污染实验室和环境。

（3）实验操作应分区域进行（试剂准备区、样本制备区、扩增区），每一区域都须有专用的仪器设备。所有台面、地面可以使用10%次氯酸钠清洁。

（4）本品使用与保存过程中应注意避光，尽量避免反复冻融。如每次使用量较少，推荐小份分装使用。

（5）本品检测灵敏度极高，空气中微量的核酸气溶胶可以引起污染，推荐使用专用的移液器，使用带滤芯的一次性吸头。使用过的枪头应收集到含10%次氯酸钠的废物缸中，检测结束的PCR反应管严禁开盖。

鼠疫耶尔森菌（鼠疫杆菌）属于高致病性病原微生物（危害程度第二类），其样本处理具有极高的气溶胶感染风险。所有疑似鼠疫样本的采集、运输、前处理及检测，必须在具备资质的生物安全三级实验室中进行，并由经过专业培训的人员严格按《人间传染的病原微生物名录》及WS 279-2008等规范操作。

以下内容仅为专业技术参考，严禁作为非BSL-3环境下的操作指南。任何违规操作均可能导致致命感染及法律责任。

【操作步骤】

1.样本处理

血液样本：抗凝管采集的血液经离心沉淀，取沉淀备用；未经过抗凝处理的血液样品，使用全血样品。

淋巴结穿刺液：取适量待检样本，加入等体积的PBS或生理盐水，充分混匀，直接提取。

痰液及咽拭子样本：加入等体积N-乙酰半胱氨酸液化30min，涡旋混匀，吸取适当液体进行提。

咽拭子样本：将拭子放入装有200µL PBS或生理盐水的离心管中充分振荡，吸取适当液体进行提取。

2.核酸提取

提取法：推荐使用本公司“病毒核酸DNA/RNA提取试剂盒（柱提法）”或者“核酸提取纯化试剂盒（适配机提）”。

3.反应液配制

室温操作，每个反应的体积为25 μL；每个反应管中加入20μLPCR反应液；依次取5 μL阴性对照、待测样品、阳性对照到PCR反应管中，瞬时离心备用。

4.PCR扩增

将PCR反应管转移到荧光PCR仪上。明确仪器是底部采光还是上方采光，如果是PCR管盖上方采光，使用PCR反应管或八联排管时，要使用光学平盖，不要在盖子上做标记，盖盖子时要用新的手套。若仪器是底部采光，要保持PCR反应管底部透光清洁。

将PCR反应管放置在仪器样本槽相应位置，记录放置顺序。设置仪器运行参数，进行PCR扩增。

【结果判定】

1.质控标准

阳性对照Ct值≤30并出现典型的S型扩增曲线；

阴性对照无Ct值或无特征性扩增曲线时实验成立。

2.结果描述及判定

阳性：样本检测结果Ct值≤38，扩增曲线呈现典型的S型；

疑似样本，需要复测：样本检测结果Ct值＞38，需要复测，若复测结果仍有Ct值，且扩增曲线呈现典型的S型，则判断为阳性，否则为阴性。

阴性：样本检测结果无Ct值或无典型的S型曲线，判为阴性。对于某些未呈现S型曲线，但本底较高的样品，应判定为阴性。

【生产企业】  武汉光启生物科技有限公司

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