大鼠脉络膜微血管内皮细胞

方法简介  实验室分离的大鼠脉络膜微血管内皮细胞采用胶原酶-中性蛋白酶混合消化法结合密度梯度离心法、最后通过内皮细胞专用培养基培养筛选制备而来。

质量检测  实验室分离的大鼠脉络膜微血管内皮细胞经CD31免疫荧光鉴定，纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

包被条件： PLL（0.1 mg/mL）或明胶（0.1%）

培养基： 大鼠脉络膜微血管内皮细胞完全培养基(含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率： 每2-3天换液一次

生长特性： 贴壁

细胞形态： 内皮细胞样

传代比例： 1:2

传代特性： 可传2-3代

消化液： 0.25%胰蛋白酶

大鼠脉络膜微血管内皮细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

前置准备

实验动物：SD大鼠，每只可获得2-5x10^5个内皮细胞，活力>85%

试剂：0.25%胰蛋白酶、II型胶原酶、DNase I、DMEM/F12培养基、胎牛血清(FBS)、PBS缓冲液、兔抗细胞CD31抗体(用于流式分选)、ECM基质胶

分离纯化步骤

取实验动物目标血管/组织，用预冷PBS冲洗去除血液，仔细分离去除外膜和脂肪组织

将组织剪碎后加入0.25%胰蛋白酶，37度消化15-20分钟，收集消化液

再加入II型胶原酶，37度振荡消化45-60分钟，充分分散组织

消化液经70um和40um滤网依次过滤，300g离心10分钟收集细胞

用含CD31抗体的磁珠进行阳性/阴性分选，或采用差速贴壁法去除成纤维细胞，收集CD31+内皮细胞

原代培养要点

将纯化后的内皮细胞接种于明胶预包被的培养皿中，使用ECM基质胶包被可显著提高贴壁率

接种密度建议3x10^4 cells/cm2，37度、5% CO2培养，内皮细胞通常24-72小时贴壁

使用内皮细胞专用培养基(含20%FBS、EGF 5ng/mL、FGF 2ng/mL、肝素10ug/mL)

每2-3天换液一次，细胞融合至80-90%时可用0.05%胰蛋白酶-EDTA传代

常见问题优化

内皮细胞被成纤维细胞污染：采用差速贴壁法2-3次，或CD31磁珠分选提高纯度

内皮细胞凋亡：培养基中添加ROCK抑制剂Y-27632(10uM)可显著提高存活率

表达内皮标志物下降：传代次数控制在3代以内，冻存早期细胞以备后续使用

一、实验前准备

器械：显微镊子、显微剪刀、眼科剪、培养皿、离心管、滤网（200 目 / 400 目）、移液枪套装

试剂：预冷 PBS、DMEM 完全培养基（10% 胎牛血清 + 双抗 + 内皮细胞生长添加剂 ECGS）、0.25% 胰蛋白酶 - EDTA、Ⅱ 型胶原酶、BSA 封闭液

耗材：细胞培养瓶、细胞筛、冻存管、无菌纱布

二、取材与预处理

脱颈处死大鼠，75% 酒精浸泡头部消毒 1min，沿颅中线剪开颅骨，完整剥离眼球。

无菌 PBS 漂洗眼球 3 次，剪开眼球巩膜，剔除视网膜、晶状体，小心剥离脉络膜组织，剪碎至 1mm³ 细小组织块，预冷 PBS 反复漂洗去除血污。

三、细胞分离与消化

组织碎块加入 0.1%Ⅱ 型胶原酶，37℃恒温摇床消化 30~40min，每 10min 轻柔吹打 1 次。

加入含血清完全培养基终止消化，200 目滤网初步过滤去除大块组织残渣。

滤液 1000r/min 离心 5min，弃上清，沉淀用 PBS 重悬洗涤 2 次。

四、纯化与接种培养

细胞悬液铺入明胶提前包被的培养瓶，37℃5% CO₂孵箱差速贴壁 1.5h，吸出上清去除成纤维细胞杂细胞。

上清转移至新包被培养瓶继续培养，每 2d 更换一次内皮专用完全培养基。

细胞汇合度 80% 即可传代，常规胰酶消化传代，可通过 CD31 免疫荧光鉴定内皮纯度。