大鼠卵巢颗粒细胞

方法简介  实验室分离的大鼠卵巢颗粒细胞采用先机械分离，而后胶原酶消化，最后差速贴壁法制备而来。

质量检测  实验室分离的大鼠卵巢颗粒细胞经FSHR免疫荧光鉴定，纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

包被条件： PLL（0.1 mg/mL）

培养基： 大鼠卵巢颗粒细胞完全培养基(含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率： 每2-3天换液一次

生长特性： 贴壁

细胞形态： 上皮细胞样

传代比例： 1:2

传代特性： 可传1-2代

消化液： 0.25%胰蛋白酶

大鼠卵巢颗粒细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

前置准备

实验动物：SD大鼠，取卵巢组织

试剂：0.25%胰蛋白酶、II型胶原酶、DNase I、DMEM/F12培养基、胎牛血清(FBS)、PBS缓冲液、DMEM/F12培养基、FBS、PBS、FSH、EGF

分离纯化步骤

取实验动物卵巢组织，仔细去除卵巢系膜和血管

剪碎组织后采用胶原酶消化法(37度、1-2小时)分散细胞

过滤后300g离心8分钟收集细胞

采用密度梯度离心或免疫磁珠分选富集目标细胞类型

原代培养要点

卵巢颗粒细胞：使用DMEM/F12+5%FBS+10ng/mL EGF+FSH(1ug/mL)培养基

卵巢卵泡膜细胞：使用DMEM/F12+10%FBS培养基，37度、5% CO2培养

每2-3天换液一次，根据细胞类型调整培养条件

常见问题优化

颗粒细胞存活率低：添加FSH和EGF可显著提高颗粒细胞存活和增殖

卵泡膜细胞污染：采用免疫磁珠分选提高纯度

细胞表型维持：控制传代次数，原代培养结果更可靠

一、实验前准备

显微剪、注射器针头、滤网；DMEM/F12、胶原酶、PBS、双抗。

选用动情周期大鼠，实验用品无菌处理。

二、取材与预处理

摘取大鼠卵巢，PBS 冲洗干净，剔除周边多余组织。

显微镜下用针头刺破卵巢表面各级卵泡，释放卵泡液与颗粒细胞团。

三、细胞分离与消化

收集卵泡内容物，加入胶原酶 37℃消化 20min，吹打打散颗粒细胞团。

胰酶短时消化 5min 进一步解离单细胞，血清终止酶反应。

混匀细胞悬液备用。

四、纯化与接种培养

悬液过筛离心，PBS 洗涤沉淀。

完全培养基重悬铺板接种。

24h 换液去除卵母细胞与杂质，贴壁细胞即为卵巢颗粒细胞。