大鼠卵巢成纤维细胞

方法简介  实验室分离的大鼠卵巢成纤维细胞采用胰蛋白酶-胶原酶混合消化法结合差速贴壁法制备而来。

质量检测  实验室分离的大鼠卵巢成纤维细胞经Vimentin免疫荧光鉴定，纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

培养基： 大鼠卵巢成纤维细胞完全培养基(含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率： 每2-3天换液一次

生长特性： 贴壁

细胞形态： 成纤维细胞样

传代比例： 1:2

传代特性： 可传5代左右；3代以内状态最佳

消化液： 0.25%胰蛋白酶

大鼠卵巢成纤维细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

前置准备

实验动物：SD大鼠，取健康组织块约0.5-1g

试剂：0.25%胰蛋白酶、II型胶原酶、DNase I、DMEM/F12培养基、胎牛血清(FBS)、PBS缓冲液、DMEM/F12完全培养基、胎牛血清(FBS)

分离纯化步骤

取实验动物目标组织，用预冷无钙镁PBS反复冲洗去除血液和杂质

剪碎组织至1mm3大小，加入0.25%胰蛋白酶，37度消化30-40分钟

加入II型胶原酶继续消化30分钟，胎牛血清终止消化

经70um和40um滤网过滤，300g离心8分钟收集细胞沉淀

重悬细胞后接种于未包被培养皿中，37度培养24小时后换液去除悬浮细胞

原代培养要点

成纤维细胞贴壁能力强，接种后12-24小时大部分细胞贴壁，呈梭形或星形

使用DMEM/F12+10%FBS完全培养基，37度、5% CO2培养

每2-3天换液一次，细胞融合达80-90%时可用0.25%胰蛋白酶消化传代

原代成纤维细胞增殖较快，通常7-14天可达融合状态

常见问题优化

成纤维细胞生长过快：适当降低FBS浓度至5-10%可减缓生长速度

细胞老化：控制传代次数在10代以内，早期代次实验结果更可靠

交叉污染：严格无菌操作，注意区分成纤维细胞与肌成纤维细胞表型

一、实验前准备

精细解剖器械、细胞筛；DMEM 培养基、胰酶、胶原酶 Ⅰ、PBS、FBS。

耗材高压灭菌，超净台紫外消毒。

二、取材与预处理

无菌摘取大鼠双侧卵巢，剔除卵巢外侧系膜、脂肪组织。

PBS 漂洗卵巢组织 3 次，剪去卵泡突出部分，取卵巢间质结缔组织。

将组织剪碎成糊状碎块。

三、细胞分离与消化

Ⅰ 型胶原酶 37℃消化 40min，打散组织团块；再加入胰酶消化 15min。

血清终止消化，反复吹打充分解离细胞。

静置片刻，吸取上层细胞悬液。

四、纯化与接种培养

过滤离心收集细胞沉淀，培养基重悬接种。

差速贴壁法：1.5h 换液，先贴壁的即为卵巢间质成纤维细胞。

常规换液传代培养。