大鼠淋巴结淋巴细胞

方法简介  实验室分离的大鼠淋巴结淋巴细胞采用分离淋巴结组织、研磨获取单细胞悬液后通过密度梯度离心法制备而来。

质量检测  实验室分离的大鼠淋巴结淋巴细胞，不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

培养基： 大鼠淋巴结淋巴细胞完全培养基(含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率： 每2-3天换液一次

生长特性： 悬浮

细胞形态： 圆形

传代比例： 不传代

传代特性： 不增殖；不传代

消化液： 0.25%胰蛋白酶

大鼠淋巴结淋巴细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

前置准备

实验动物：SD大鼠，采集血液或提取组织免疫细胞

试剂：Ficoll密度梯度分离液、PBS缓冲液、DMEM/F12培养基、胎牛血清(FBS)、RPIM-1640或DMEM/F12培养基、胎牛血清(FBS)

分离纯化步骤

采集实验动物全血或获取组织悬液，用PBS稀释至适当体积

缓慢叠加于Ficoll密度梯度分离液上方，室温2000rpm离心20分钟

收集界面白色单个核细胞层，用PBS洗涤2次，300g离心8分钟

用含10%FBS的RPIM-1640完全培养基重悬细胞，计数并检测活力

可采用磁珠分选法进一步富集目标免疫细胞亚群(如CD11b+巨噬细胞、CD3+T细胞等)

原代培养要点

免疫细胞多为悬浮或弱贴壁生长，使用完全培养基RPIM-1640+10%FBS+1%双抗

37度、5% CO2培养，初始接种密度建议1x10^6 cells/mL

巨噬细胞培养可添加M-CSF(20ng/mL)促进增殖和维持表型

T细胞培养需添加IL-2(10ng/mL)和抗CD3/CD28抗体刺激增殖

常见问题优化

免疫细胞活力差：操作全程保持低温，避免反复离心和吹打

细胞凋亡：培养基中添加IL-4(20ng/mL)和IL-10(10ng/mL)可抑制巨噬细胞凋亡

纯度不够：采用MACS磁珠分选可获得纯度>95%的目标免疫细胞

一、实验前准备

解剖镊、筛网（200 目）、离心管；RPMI1640 培养基、淋巴细胞分离液、PBS、双抗。

无菌操作台面提前消杀。

二、取材与预处理

大鼠处死，摘取腹股沟、腋窝、肠系膜淋巴结，剥离淋巴结外层包膜与脂肪。

预冷 PBS 浸泡淋巴结，去除表面血污。

三、细胞分离与消化

将淋巴结置于 200 目筛网上，研磨棒轻柔碾压淋巴结，细胞随 PBS 穿过筛网收集。

吸取细胞悬液缓慢叠加于淋巴细胞分离液上层，梯度离心。

离心后吸取中间白膜层即为淋巴细胞富集层。

四、纯化与接种培养

收集白膜层细胞，PBS 离心洗涤 2 次去除分离液残留。

RPMI1640 完全培养基重悬细胞，悬浮培养于培养瓶。

可加入 ConA 等刺激剂诱导活化，每 2 天半量换液。