大鼠髋臼软骨细胞

方法简介  实验室分离的大鼠髋臼软骨细胞采用胶原酶联合中性蛋白酶消化制备而来。

质量检测  实验室分离的大鼠髋臼软骨细胞，P0代经Ⅱ型胶原蛋白免疫荧光鉴定，纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

培养基： 大鼠髋臼软骨细胞完全培养基(含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率： 每2-3天换液一次

生长特性： 贴壁

细胞形态： 梭形、多角形

传代比例： 1:2

传代特性： 可传3代左右

消化液： 0.25%胰蛋白酶

大鼠髋臼软骨细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

前置准备

实验动物：SD大鼠，取胫骨/股骨/关节软骨等组织

试剂：0.25%胰蛋白酶、II型胶原酶、DNase I、DMEM/F12培养基、胎牛血清(FBS)、PBS缓冲液、DMEM/F12培养基、FBS、PBS

分离纯化步骤

取实验动物目标骨组织或软骨组织，仔细去除软组织包膜

骨组织：剪碎后用0.25%胰蛋白酶消化20分钟，再加入II型胶原酶消化60-90分钟

软骨组织：剪碎后直接用II型胶原酶37度振荡消化4-6小时

消化液经70um和40um滤网过滤，400g离心10分钟收集细胞

原代培养要点

成骨细胞：使用DMEM+10%FBS培养基，37度、5% CO2培养，细胞呈多角形贴壁

软骨细胞：使用DMEM/F12+10%FBS+10ng/mL TGF-beta3培养基，可悬浮或三维培养

成骨细胞培养14-21天后可检测到ALP活性和矿化结节形成

软骨细胞传代后易去分化，建议采用低传代次数(2-3代)或三维球状培养维持表型

常见问题优化

骨细胞得率低：延长胶原酶消化时间至90分钟，或采用两次消化法

软骨细胞去分化：采用高浓度悬浮培养(1x10^5 cells/mL)维持软骨表型

成骨细胞污染：采用差速贴壁法或免疫磁珠分选提高成骨细胞纯度

一、实验前准备

骨科剪、咬骨钳、显微镊；DMEM/F12、Ⅱ 型胶原酶、PBS、双抗、FBS。

选用 4~6 周龄大鼠，器械彻底灭菌。

二、取材与预处理

大鼠处死后剪开髋关节，暴露髋臼关节窝，小心刮取髋臼表面透明软骨组织。

PBS 冲净骨屑与血迹，剔除下方骨组织，仅保留纯白软骨薄片。

将软骨剪切成极小碎粒，预冷 PBS 漂洗 2 次。

三、细胞分离与消化

软骨碎块加入 0.2%Ⅱ 型胶原酶，37℃摇床消化 4~6h。

每 1h 吹打一次，直至软骨基本溶解分散。

血清终止消化，收集细胞悬液。

四、纯化与接种培养

200 目滤网过滤骨残渣，1000rpm 离心 6min，洗涤细胞沉淀。

完全培养基重悬细胞接种培养瓶。

48h 换液去除未贴壁细胞，常规培养扩增。