大鼠精原干细胞

方法简介  实验室分离的大鼠精原干细胞采用先机械吹打、后胰蛋白酶消化，结合Percoll密度梯度离心法制备而来。

质量检测  实验室分离的大鼠精原干细胞经c-kit免疫荧光鉴定，纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

培养基： 大鼠精原干细胞完全培养基(含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率： 每2-3天换液一次

生长特性： 贴壁

细胞形态： 梭形、圆形

传代比例： 1:2

传代特性： 可传1-2代

消化液： 0.25%胰蛋白酶

大鼠精原干细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

前置准备

实验动物：SD大鼠，取材需严格无菌操作

试剂：0.25%胰蛋白酶、II型胶原酶、DNase I、DMEM/F12培养基、胎牛血清(FBS)、PBS缓冲液、MSC专用培养基/干细胞专用培养基、FBS、beta-巯基乙醇、L-谷氨酰胺

分离纯化步骤

从实验动物目标组织(骨髓/脂肪/脐带/牙髓等)中分离间充质成分

组织剪碎后经胶原酶消化(37度、2小时)，过滤获取单细胞悬液

采用密度梯度离心(Ficoll)纯化单个核细胞层

将细胞接种于培养皿中，间充质干细胞24-48小时贴壁，非贴壁细胞换液去除

贴壁细胞扩大培养至60-70%融合后，流式分选CD90+/CD105+/CD34-/CD45-细胞

原代培养要点

干细胞培养需使用专用培养基(含20%FBS的MSC培养基或DMEM/F12+20%FBS)

接种密度建议5x10^3-1x10^4 cells/cm2，37度、5% CO2培养

每2-3天换液一次，间充质干细胞呈梭形贴壁生长，融合达80%时传代

干细胞具有三系分化潜能，可在诱导培养基中向成骨/成脂/成软骨方向分化

常见问题优化

干细胞增殖缓慢：添加FGF-2(10ng/mL)和EGF(10ng/mL)可促进增殖

干细胞分化潜能下降：控制传代次数在3-5代以内，避免过度扩增

细胞纯度不高：采用流式分选CD90+/CD105+双阳性标记可提高纯度

一、实验前准备

解剖剪、镊子、不锈钢筛网（80 目 / 200 目）；DMEM 培养基、胶原酶 Ⅳ、胰酶、DNaseⅠ、PBS、双抗。

选用 7~10 日龄幼鼠，提前器械灭菌。

二、取材与预处理

处死大鼠，无菌摘取双侧睾丸，剔除睾丸外层白膜与附睾粘连组织。

预冷含双抗 PBS 漂洗睾丸组织 3 次，去除血液污染。

三、细胞分离与消化

剪开睾丸白膜，取出曲细精管组织团块，剪碎后加入 Ⅳ 型胶原酶 37℃消化 15min，打散间质组织。

离心弃上清，沉淀加入胰酶 + DNaseⅠ 混合消化液，37℃消化 12min，解离生精细胞团。

血清终止消化，反复吹打制备单细胞悬液。

四、纯化与接种培养

依次过 80 目、200 目筛，离心洗涤细胞 3 次。

采用差速贴壁法：先铺板 2h，贴壁细胞为支持细胞，吸取上清悬浮细胞即为富集精原干细胞。

干细胞专用培养基重悬接种，置于培养箱培养，定期换液。