大鼠角膜内皮细胞

方法简介  实验室分离的大鼠角膜内皮细胞采用混合胶原酶消化结合内皮细胞专用培养基培养筛选制备而来。

质量检测  实验室分离的大鼠角膜内皮细胞经NSE（神经元特异性烯醇化酶）免疫荧光鉴定，纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

包被条件： PLL（0.1 mg/mL）或明胶（0.1%）

培养基： 大鼠角膜内皮细胞完全培养基(含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率： 每2-3天换液一次

生长特性： 贴壁

细胞形态： 内皮细胞样

传代比例： 1:2

传代特性： 可传2-3代

消化液： 0.25%胰蛋白酶

大鼠角膜内皮细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

前置准备

实验动物：SD大鼠，每只可获得2-5x10^5个内皮细胞，活力>85%

试剂：0.25%胰蛋白酶、II型胶原酶、DNase I、DMEM/F12培养基、胎牛血清(FBS)、PBS缓冲液、兔抗细胞CD31抗体(用于流式分选)、ECM基质胶

分离纯化步骤

取实验动物目标血管/组织，用预冷PBS冲洗去除血液，仔细分离去除外膜和脂肪组织

将组织剪碎后加入0.25%胰蛋白酶，37度消化15-20分钟，收集消化液

再加入II型胶原酶，37度振荡消化45-60分钟，充分分散组织

消化液经70um和40um滤网依次过滤，300g离心10分钟收集细胞

用含CD31抗体的磁珠进行阳性/阴性分选，或采用差速贴壁法去除成纤维细胞，收集CD31+内皮细胞

原代培养要点

将纯化后的内皮细胞接种于明胶预包被的培养皿中，使用ECM基质胶包被可显著提高贴壁率

接种密度建议3x10^4 cells/cm2，37度、5% CO2培养，内皮细胞通常24-72小时贴壁

使用内皮细胞专用培养基(含20%FBS、EGF 5ng/mL、FGF 2ng/mL、肝素10ug/mL)

每2-3天换液一次，细胞融合至80-90%时可用0.05%胰蛋白酶-EDTA传代

常见问题优化

内皮细胞被成纤维细胞污染：采用差速贴壁法2-3次，或CD31磁珠分选提高纯度

内皮细胞凋亡：培养基中添加ROCK抑制剂Y-27632(10uM)可显著提高存活率

表达内皮标志物下降：传代次数控制在3代以内，冻存早期细胞以备后续使用

一、实验前准备

器械：显微镊、显微剪、角膜环钻、眼科剪、止血钳；培养皿、离心管、细胞培养瓶、滤网（200 目）。

试剂：DMEM/F12 完全培养基、PBS 缓冲液、0.25% 胰蛋白酶 - EDTA、0.1%Ⅱ 型胶原酶、双抗（青霉素 + 链霉素）、75% 医用酒精。

动物预处理：SD 大鼠（6~8 周龄）称重，提前备好麻醉剂（10% 水合氯醛），操作台紫外灭菌 30min。

二、取材与预处理

大鼠腹腔注射水合氯醛麻醉，颈椎脱臼处死，眼部喷洒 75% 酒精消毒眼周皮肤。

显微镊夹持眼球外壁完整摘取眼球，放入预冷含双抗 PBS 中漂洗 3 次，去除血污与结膜组织。

显微镜下沿角膜缘剪开巩膜，剥离晶状体与虹膜组织，单独分离完整角膜片，内皮面朝上放置。

三、细胞分离与消化

角膜内皮面向下浸入 0.25% 胰酶，37℃孵育 15min，轻晃培养皿使内皮细胞脱落。

加入等量完全培养基终止胰酶消化，反复吹打角膜内皮面 5~8 次，收集细胞悬液。

剩余角膜组织加入 0.1%Ⅱ 型胶原酶 37℃消化 20min，再次吹打收集上清，合并两次悬液。

四、纯化与接种培养

细胞悬液过 200 目细胞滤网去除组织碎屑，1000r/min 离心 5min，弃上清。

预冷 PBS 重悬沉淀再次离心洗涤 1 次，用完全培养基重悬细胞沉淀。

按 1×10⁵个 /mL 接种于培养瓶，37℃、5% CO₂培养箱静置培养，24h 后换液去除未贴壁杂细胞。