大鼠脊髓神经元细胞

方法简介  实验室分离的大鼠脊髓神经元细胞采用胶原酶-胰酶联合消化法、神经元专用培养基培养筛选结合化学试剂抑制法制备而来。

质量检测  实验室分离的大鼠脊髓神经元细胞经β-Tubulin-Ⅲ免疫荧光鉴定，纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

包被条件： PLL（0.1 mg/mL）

培养基： 大鼠脊髓神经元细胞完全培养基(含B-27 Supplement、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率： 每2-3天换液一次

生长特性： 贴壁

细胞形态： 神经元细胞样

传代比例： 不传代

传代特性： 属于终末分化细胞；属于不增殖细胞群

消化液： 0.125%胰蛋白酶

大鼠脊髓神经元细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

前置准备

实验动物：SD大鼠，需快速取材以保证神经元活力

试剂：0.25%胰蛋白酶、II型胶原酶、DNase I、DMEM/F12培养基、胎牛血清(FBS)、PBS缓冲液、Neurobasal培养基、B27添加剂、NGF、BDNF、NT-3、聚赖氨酸、脑基质胶

分离纯化步骤

取实验动物目标脑区/脊髓/神经组织，用预冷无钙镁PBS仔细冲洗

在显微镜下仔细分离目标区域，去除血管和膜组织，剪碎至1mm3

用0.25%胰蛋白酶在37度消化15-20分钟，加入DNase I辅助消化

用含FBS的DMEM终止消化，移液器轻柔吹打制成单细胞悬液

经40um滤网过滤后，300g离心5分钟收集神经元细胞

原代培养要点

将神经元细胞接种于聚赖氨酸包被的盖玻片或培养皿中，使用Neurobasal+B27培养基

接种密度建议1-2x10^5 cells/cm2，37度、5% CO2、95%湿度培养

神经元培养需添加NGF(10ng/mL)、BDNF(10ng/mL)等神经营养因子

7-14天后可观察到明显的神经元突起生长，21天后形成神经网络

常见问题优化

神经元存活率低：培养基中添加GlutaMAX和丙酮酸钠可提高神经元存活率

胶质细胞过度生长：使用Ara-C(10uM)处理可抑制胶质细胞增殖

神经元突起生长不良：添加NGF、BDNF等神经营养因子，使用脑基质胶包被基底

一、实验前准备

解剖器械灭菌；DMEM 高糖完全培养基、0.25% 胰酶、PBS；培养瓶、细胞筛。

新生乳鼠取材，操作台紫外消毒。

二、取材与预处理

取出脊髓组织，彻底剥离脊膜，PBS 清洗后剪碎组织小块。

三、细胞分离与消化

胰酶 37℃消化 20min，间断吹打解离组织。

培养基终止消化，吹打混匀过滤得到细胞悬液。

四、纯化与接种培养

悬液接种培养瓶静置培养，7d 左右细胞单层汇合。

摇床低速震荡去除小胶质、少突胶质细胞。

胰酶消化传代 1 次，即为纯化脊髓星形胶质细胞。