大鼠脊髓神经干细胞

方法简介  实验室分离的大鼠脊髓神经干细胞采用胰蛋白酶消化后差速贴壁，结合神经干细胞专用培养基培养筛选制备而来。

质量检测  实验室分离的大鼠脊髓神经干细胞经Nestin免疫荧光鉴定，纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

培养基： 大鼠脊髓神经干细胞完全培养基(含B-27 Supplement、EGF、bFGF、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率： 每2-3天换液一次

生长特性： 悬浮

细胞形态： 球形

传代比例： 1:2

传代特性： 可传2-3代

消化液： Accutase消化液或0.25%胰蛋白酶

大鼠脊髓神经干细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

前置准备

实验动物：SD大鼠，取材需严格无菌操作

试剂：0.25%胰蛋白酶、II型胶原酶、DNase I、DMEM/F12培养基、胎牛血清(FBS)、PBS缓冲液、MSC专用培养基/干细胞专用培养基、FBS、beta-巯基乙醇、L-谷氨酰胺

分离纯化步骤

从实验动物目标组织(骨髓/脂肪/脐带/牙髓等)中分离间充质成分

组织剪碎后经胶原酶消化(37度、2小时)，过滤获取单细胞悬液

采用密度梯度离心(Ficoll)纯化单个核细胞层

将细胞接种于培养皿中，间充质干细胞24-48小时贴壁，非贴壁细胞换液去除

贴壁细胞扩大培养至60-70%融合后，流式分选CD90+/CD105+/CD34-/CD45-细胞

原代培养要点

干细胞培养需使用专用培养基(含20%FBS的MSC培养基或DMEM/F12+20%FBS)

接种密度建议5x10^3-1x10^4 cells/cm2，37度、5% CO2培养

每2-3天换液一次，间充质干细胞呈梭形贴壁生长，融合达80%时传代

干细胞具有三系分化潜能，可在诱导培养基中向成骨/成脂/成软骨方向分化

常见问题优化

干细胞增殖缓慢：添加FGF-2(10ng/mL)和EGF(10ng/mL)可促进增殖

干细胞分化潜能下降：控制传代次数在3-5代以内，避免过度扩增

细胞纯度不高：采用流式分选CD90+/CD105+双阳性标记可提高纯度

一、实验前准备

显微解剖工具灭菌；DMEM 完全培养基、胰酶消化液、PBS；摇床、细胞筛、培养瓶。

提前制备星形胶质细胞饲养层，或采用差速震荡纯化方案。

二、取材与预处理

取新生大鼠脊髓组织，剥离脊膜，PBS 冲洗后剪碎组织。

三、细胞分离与消化

胰酶 37℃消化 20min，吹打分散细胞。

血清培养基终止消化，过滤制备混合胶质细胞悬液。

四、纯化与接种培养

接种培养瓶培养 7~9d，待混合胶质铺满瓶底。

恒温摇床 220r/min 震荡 18h，少突胶质细胞脱落悬浮，收集上清。

上清离心接种新培养瓶，贴壁培养即为纯化脊髓少突胶质细胞。