大鼠肌腱成纤维细胞

方法简介  实验室分离的大鼠肌腱成纤维细胞采用混合胶原酶消化法结合差速贴壁法制备而来。

质量检测  实验室分离的大鼠肌腱成纤维细胞经Vimentin免疫荧光鉴定，纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

培养基： 大鼠肌腱成纤维细胞完全培养基(含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率： 每2-3天换液一次

生长特性： 贴壁

细胞形态： 成纤维细胞样

传代比例： 1:2

传代特性： 可传5代左右；3代以内状态最佳

消化液： 0.25%胰蛋白酶

大鼠肌腱成纤维细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

前置准备

实验动物：SD大鼠，取健康组织块约0.5-1g

试剂：0.25%胰蛋白酶、II型胶原酶、DNase I、DMEM/F12培养基、胎牛血清(FBS)、PBS缓冲液、DMEM/F12完全培养基、胎牛血清(FBS)

分离纯化步骤

取实验动物目标组织，用预冷无钙镁PBS反复冲洗去除血液和杂质

剪碎组织至1mm3大小，加入0.25%胰蛋白酶，37度消化30-40分钟

加入II型胶原酶继续消化30分钟，胎牛血清终止消化

经70um和40um滤网过滤，300g离心8分钟收集细胞沉淀

重悬细胞后接种于未包被培养皿中，37度培养24小时后换液去除悬浮细胞

原代培养要点

成纤维细胞贴壁能力强，接种后12-24小时大部分细胞贴壁，呈梭形或星形

使用DMEM/F12+10%FBS完全培养基，37度、5% CO2培养

每2-3天换液一次，细胞融合达80-90%时可用0.25%胰蛋白酶消化传代

原代成纤维细胞增殖较快，通常7-14天可达融合状态

常见问题优化

成纤维细胞生长过快：适当降低FBS浓度至5-10%可减缓生长速度

细胞老化：控制传代次数在10代以内，早期代次实验结果更可靠

交叉污染：严格无菌操作，注意区分成纤维细胞与肌成纤维细胞表型

一、实验前准备

无菌显微器械；干细胞基础培养基、0.15% 胶原酶 + 胰酶复合消化液、PBS；细胞筛、培养瓶。

全程冰上取材，降低细胞凋亡。

二、取材与预处理

摘取大鼠跟腱组织，彻底剥离腱鞘及周围软组织，预冷 PBS 多次冲洗。

将肌腱充分剪碎至糊状组织糜。

三、细胞分离与消化

复合消化液 37℃消化 90min，每 20min 吹打一次。

加入胎牛血清终止消化，吹打制成悬液。

依次过 100 目、200 目滤网过滤。

四、纯化与接种培养

低速离心收集细胞，干细胞培养基重悬接种。

48h 首次换液，丢弃悬浮凋亡细胞。

每 3d 换液，克隆样增殖后传代，通过有限稀释法进一步单克隆纯化肌腱干细胞。