大鼠关节软骨细胞

方法简介  实验室分离的大鼠关节软骨细胞采用胶原酶联合中性蛋白酶消化制备而来。

质量检测  实验室分离的大鼠关节软骨细胞，P0代经Ⅱ型胶原蛋白免疫荧光鉴定，纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

培养基： 大鼠关节软骨细胞完全培养基(含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率： 每3-4天换液一次

生长特性： 贴壁

细胞形态： 梭形、多角形

传代比例： 1:2

传代特性： 可传5代左右；3代以内状态最佳

消化液： 0.25%胰蛋白酶

大鼠关节软骨细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

前置准备

实验动物：SD大鼠，取胫骨/股骨/关节软骨等组织

试剂：0.25%胰蛋白酶、II型胶原酶、DNase I、DMEM/F12培养基、胎牛血清(FBS)、PBS缓冲液、DMEM/F12培养基、FBS、PBS

分离纯化步骤

取实验动物目标骨组织或软骨组织，仔细去除软组织包膜

骨组织：剪碎后用0.25%胰蛋白酶消化20分钟，再加入II型胶原酶消化60-90分钟

软骨组织：剪碎后直接用II型胶原酶37度振荡消化4-6小时

消化液经70um和40um滤网过滤，400g离心10分钟收集细胞

原代培养要点

成骨细胞：使用DMEM+10%FBS培养基，37度、5% CO2培养，细胞呈多角形贴壁

软骨细胞：使用DMEM/F12+10%FBS+10ng/mL TGF-beta3培养基，可悬浮或三维培养

成骨细胞培养14-21天后可检测到ALP活性和矿化结节形成

软骨细胞传代后易去分化，建议采用低传代次数(2-3代)或三维球状培养维持表型

常见问题优化

骨细胞得率低：延长胶原酶消化时间至90分钟，或采用两次消化法

软骨细胞去分化：采用高浓度悬浮培养(1x10^5 cells/mL)维持软骨表型

成骨细胞污染：采用差速贴壁法或免疫磁珠分选提高成骨细胞纯度

一、实验前准备

1. 器械：显微剪、弯镊、培养皿；试剂：0.2%Ⅱ 型胶原酶、DMEM、双抗、FBS

2. 动物：4 周龄大鼠膝关节

二、取材与预处理

1. 处死大鼠剪开膝关节腔，用显微器械削取股骨髁、胫骨平台透明软骨

2. PBS 冲洗软骨片，剔除粘连滑膜与结缔组织，剪碎至 0.5mm 细小碎片

三、细胞分离与消化

1. 软骨碎块加入 Ⅱ 型胶原酶，37℃摇床消化 4~6h 至组织基本消散

2. 完全培养基终止消化，过 200 目滤网收集细胞悬液

四、纯化与接种培养

1. 悬液 1000rpm 离心 5min，PBS 洗涤 2 次

2. 完全培养基重悬细胞，调整密度接种培养瓶

3. 24h 贴壁后换液，常规培养，避免多次传代防止去分化