大鼠骨髓间充质干细胞

大鼠骨髓间充质干细胞

运用密度梯度离心法从Sprague-Dawley大鼠骨髓间充质干细胞组织中分离间充质干细胞，经预培养去除非贴壁细胞后，选用含 10% FBS 和 2 mM L-谷氨酰胺的 DMEM/F12 培养基进行扩增；通过免疫荧光染色检测 Nanog、Oct4、Sox2 等多能性标志物表达，流式细胞术分析 CD34-、CD45-、HLA-DR- 表型，并经体外诱导分化实验（成骨/成脂/成软骨）验证多向分化潜能。

产品名称：大鼠骨髓间充质干细胞

英文名称： Rat Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells

组织来源： 腿骨髓组织

默认种属 ：SD大鼠

产品规格：5×10^5Cells/T25

方法简介  实验室分离的大鼠骨髓间充质干细胞采用冲洗骨髓、密度梯度离心、差速贴壁法结合培养基筛选制备而来。

质量检测  实验室分离的大鼠骨髓间充质干细胞经CD90或CD44免疫荧光鉴定，纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

培养基： 大鼠骨髓间充质干细胞完全培养基(含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率： 每2-3天换液一次

生长特性： 贴壁

细胞形态： 成纤维细胞样

传代比例： 1:2

传代特性： 可传5代左右；3代以内状态最佳

消化液： 0.25%胰蛋白酶

大鼠骨髓间充质干细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

一、实验前准备

1. 灭菌解剖工具、70μm 细胞筛、15mL 离心管；配制含 10% FBS + 双抗的 α-MEM 完全培养基

2. 0.25% 胰酶、PBS 缓冲液；SPF 级 SD 大鼠（3~5 周）

二、取材与预处理

1. 大鼠脱臼处死，75% 乙醇浸泡 5min 消毒后分离双侧股骨、胫骨

2. 剪掉骨头两端骨骺，5mL 注射器吸取预冷 PBS，从骨髓腔一端冲入，收集骨髓冲洗液

三、细胞分离与消化

1. 骨髓悬液充分吹打混匀，70μm 筛网过滤，去除骨渣组织

2. 滤液 1200rpm 离心 6min，弃上清，PBS 重悬洗涤一次

3. 本方法常规提取无需胶原酶消化，若骨髓组织结块可短暂胰酶轻消化 1min 终止

四、纯化与接种培养

1. 离心沉淀用完全培养基重悬，接种于 T25 培养瓶

2. 培养 24h 后彻底更换培养基，弃去悬浮造血细胞，后续每 3d 换液

3. 细胞长至 85% 汇合度，胰酶消化传代，P3 代细胞可用于后续实验

1.血管组织取材后需立即置于冰预冷的M199培养基中运输，尽快去除外膜结缔组织和脂肪组织。

2.培养器皿需用0.2%明胶预包被30分钟，PBS洗涤后加入内皮细胞专用培养基方可接种。

3.内皮细胞增殖较快，培养5-7天即可达到融合，传代时注意控制胰酶消化时间不宜过长。

4.培养基中需添加10ng/ml碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和10ug/ml肝素，促进内皮细胞增殖并维持表型。

5.培养期间每48小时换液一次，观察细胞融合情况，融合度达90%以上时进行传代处理。