大鼠骨骼肌成纤维细胞

方法简介  实验室分离的大鼠骨骼肌成纤维细胞采用胰蛋白酶-胶原酶混合酶消化后差速贴壁制备而来。

质量检测  实验室分离的大鼠骨骼肌成纤维细胞经Vimentin免疫荧光鉴定，纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

培养基： 大鼠骨骼肌成纤维细胞完全培养基(含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率： 每2-3天换液一次

生长特性： 贴壁

细胞形态： 成纤维细胞样

传代比例： 1:2

传代特性： 可传5代左右；3代以内状态最佳

消化液： 0.25%胰蛋白酶

大鼠骨骼肌成纤维细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

前置准备

实验动物：SD大鼠，取健康组织块约0.5-1g

试剂：0.25%胰蛋白酶、II型胶原酶、DNase I、DMEM/F12培养基、胎牛血清(FBS)、PBS缓冲液、DMEM/F12完全培养基、胎牛血清(FBS)

分离纯化步骤

取实验动物目标组织，用预冷无钙镁PBS反复冲洗去除血液和杂质

剪碎组织至1mm3大小，加入0.25%胰蛋白酶，37度消化30-40分钟

加入II型胶原酶继续消化30分钟，胎牛血清终止消化

经70um和40um滤网过滤，300g离心8分钟收集细胞沉淀

重悬细胞后接种于未包被培养皿中，37度培养24小时后换液去除悬浮细胞

原代培养要点

成纤维细胞贴壁能力强，接种后12-24小时大部分细胞贴壁，呈梭形或星形

使用DMEM/F12+10%FBS完全培养基，37度、5% CO2培养

每2-3天换液一次，细胞融合达80-90%时可用0.25%胰蛋白酶消化传代

原代成纤维细胞增殖较快，通常7-14天可达融合状态

常见问题优化

成纤维细胞生长过快：适当降低FBS浓度至5-10%可减缓生长速度

细胞老化：控制传代次数在10代以内，早期代次实验结果更可靠

交叉污染：严格无菌操作，注意区分成纤维细胞与肌成纤维细胞表型

一、实验前准备

1.试剂配制

完全培养基：DMEM 高糖基础培养基 + 10% 胎牛血清 FBS+1% 双抗（青霉素 - 链霉素 100×）；

消化液：0.25% 胰蛋白酶 - 0.02% EDTA 混合消化液；

冲洗液：无菌 PBS 缓冲液（添加 1% 双抗）；

75% 医用酒精、碘伏。

2.器械与耗材灭菌

手术剪（直剪、弯剪）、镊子两把、培养皿、离心管、细胞培养瓶、移液管、滤网（100 目细胞筛），高压蒸汽灭菌后烘干备用；超净工作台紫外照射 30min 消毒。

3.动物与环境准备

取健康 SPF 级大鼠（出生 1~3 日乳鼠最佳，成鼠亦可）；提前开启细胞培养箱设置 37℃、5% CO₂；全程无菌操作。

二、取材与预处理

1.大鼠处死体表消毒

颈椎脱臼法处死大鼠，浸入 75% 酒精浸泡 5min 充分消毒体表毛发与皮肤，转移至超净台内无菌培养皿中。

2.骨骼肌组织剥离

用无菌镊子撕开后肢腿部皮肤，分离下肢腓肠肌、股四头肌骨骼肌组织，剔除血管、筋膜、脂肪组织，仅保留纯净肌肉块；将剥离组织放入预冷含双抗 PBS 中反复漂洗 3 次，去除血污与杂质。

三、细胞分离与消化

1.组织剪碎

将洗净骨骼肌转移至新无菌培养皿，用眼科剪反复剪切组织至糊状（肉眼无明显大块组织，粒径＜1mm³）。

2.分次胰酶消化

加入足量 0.25% 胰酶消化液浸没组织碎块，37℃水浴摇床消化 15min，每 5min 轻柔吹打一次；第一次消化结束后上清转移至离心管终止消化（加入等量完全培养基）；剩余沉淀补加新胰酶重复消化 2~3 次，合并所有消化上清液。

3.终止消化过滤

全部消化上清经 100 目无菌细胞筛过滤，去除未消化组织残渣，收集滤液至无菌离心管。

四、纯化与接种培养

1.离心弃上清

滤液 1000r/min 室温离心 5min，小心吸弃上层上清液体，保留底部细胞沉淀。

2.差速贴壁纯化（去除肌卫星细胞、肌细胞）

用完全培养基重悬细胞沉淀，接种于培养瓶内，37℃培养箱孵育 40~60min；骨骼肌成纤维细胞贴壁速度远快于肌源性细胞，小心吸出未贴壁悬浮细胞弃去，仅保留瓶底贴壁细胞。

3.传代扩增培养

加入新鲜完全培养基继续培养，每 2~3 天更换一次培养基；细胞汇合度达 80%~90% 时，胰酶常规消化传代，即为纯化大鼠骨骼肌成纤维细胞。