大鼠睾丸支持细胞

方法简介  实验室分离的大鼠睾丸支持细胞采用胶原酶消化法结合差速贴壁法制备而来。

质量检测  实验室分离的大鼠睾丸支持细胞经Fas-L免疫荧光鉴定，纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

培养基： 大鼠睾丸支持细胞完全培养基(含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率： 每2-3天换液一次

生长特性： 贴壁

细胞形态： 成纤维细胞样

传代比例： 1:2

传代特性： 可传2-3代

消化液： 0.25%胰蛋白酶

大鼠睾丸支持细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

前置准备

实验动物：SD大鼠，取胰腺/睾丸/肾上腺等内分泌腺体

试剂：0.25%胰蛋白酶、II型胶原酶、DNase I、DMEM/F12培养基、胎牛血清(FBS)、PBS缓冲液、DMEM/F12培养基、FBS、PBS

分离纯化步骤

取实验动物目标内分泌腺体组织，仔细去除周围结缔组织

剪碎组织后采用胶原酶消化法(37度、45-60分钟)分散细胞

经滤网过滤后，采用密度梯度离心纯化目标细胞

胰岛细胞可采用Handy solution差速沉淀法进一步纯化

原代培养要点

胰岛beta细胞：使用CMRL-1640+10%FBS+10mM HEPES+50uM beta-巯基乙醇

睾丸间质细胞：使用DMEM/F12+10%FBS+0.1% BSA培养

肾上腺皮质细胞：使用DMEM/F12+5%FBS+0.1uM地塞米松培养

常见问题优化

胰岛细胞纯度不高：采用Handy solution梯度离心可获得纯度>90%的胰岛细胞

内分泌细胞功能维持：添加相应激素(如IGF-1、IGF-2)可维持细胞功能

细胞存活率低：培养基中添加抗坏血酸和转铁蛋白可提高存活率

一、实验前准备

试剂 PBS、0.25% 胰酶、0.1%Ⅰ 型胶原酶、DMEM/F12+10% FBS+1% 双抗完全培养基、75% 酒精。

器械 显微镊、直剪、培养皿、80 目 + 200 目细胞筛、离心管。

15~25 日龄雄性大鼠，器械高压灭菌，操作台紫外消毒。

二、取材与预处理

处死大鼠，无菌摘取睾丸，PBS 清洗血迹，逐层剥离外层包膜与脂肪组织。

撕开睾丸白膜，将内部曲细精管全部挤出，PBS 反复漂洗 4 次，去除红细胞。

剪碎曲细精管组织成 1~2mm 细小碎块。

三、细胞分离与消化

组织碎块加入胶原酶，37℃水浴消化 20min，间断吹打至管状组织松散。

加入胰蛋白酶继续消化 10min，血清培养基终止消化。

悬液依次过 80 目、200 目筛网，截留曲细精管骨架，收集下方单细胞滤液。

四、纯化与接种培养

滤液 1200rpm 离心 5min，弃上清，培养基重悬洗涤沉淀 2 遍。

细胞悬液接种培养瓶，37℃培养箱差速贴壁 2h，弃上清去除间质细胞与生精细胞。

补加新鲜完全培养基继续培养，48h 首次换液；支持细胞呈多边形铺路石样生长，每 48h 换液，可传代 1~3 代。