大鼠肝星状细胞

方法简介  实验室分离的大鼠肝星状细胞采用混合酶灌流消化、低速离心、密度梯度离心制备而来。

质量检测  实验室分离的大鼠肝星状细胞经α-SMA或Desmin免疫荧光鉴定，纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

培养基： 大鼠肝星状细胞完全培养基(含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率： 每2-3天换液一次

生长特性： 贴壁

细胞形态： 成纤维细胞样

传代比例： 1:2

传代特性： 可传5代左右；3代以内状态最佳

消化液： 0.25%胰蛋白酶

大鼠肝星状细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

前置准备

实验动物：SD大鼠，取肝脏组织约2-3g

试剂：0.25%胰蛋白酶、II型胶原酶、DNase I、DMEM/F12培养基、胎牛血清(FBS)、PBS缓冲液、William E培养基/KSOM培养基、FBS、PBS、肝素

分离纯化步骤

取实验动物肝脏组织，通过门静脉灌注0.25%胰蛋白酶(37度、20分钟)

取出肝脏，剪碎后加入II型胶原酶37度振荡消化45-60分钟

消化液经70um和40um滤网过滤，100g离心5分钟收集肝细胞

采用Percoll不连续密度梯度离心(30%/60%)纯化肝细胞

原代培养要点

肝细胞：使用William E培养基+10%FBS+100nM地塞米松+10ug/mL胰岛素

肝细胞接种后4-6小时开始贴壁，24小时内形成典型多角形上皮样细胞

肝细胞培养3-7天后功能逐渐下降，建议实验在培养7天内完成

肝星状细胞：使用DMEM/F12+10%FBS培养，细胞呈成纤维细胞样生长

常见问题优化

肝细胞活力差：灌注压力控制在10-12mmHg，消化时间严格控制

肝细胞功能丧失：培养基中添加HGF(10ng/mL)和EGF(10ng/mL)可维持肝细胞功能

肝星状细胞活化：传代后细胞逐渐活化，建议冻存早期细胞

一、实验前准备

试剂 前灌液、Ⅳ 型胶原酶肝灌流液、DNaseⅠ 消化液、18% OptiPrep 密度梯度分离液、DMEM 完全培养基（10% FBS + 双抗）、无钙镁 HBSS。

器材 蠕动泵、门静脉插管、解剖器械、15/50mL 离心管、400 目细胞筛、超速离心配套离心管。

雄性 SD 大鼠禁食过夜，超净台及器械灭菌。

二、取材与预处理

麻醉大鼠，开腹门静脉插管，下腔静脉放血，预灌液灌流肝脏至完全脱色。

胶原酶循环灌流消化肝脏 15min，摘取肝脏剪碎，转入含 DNaseⅠ 的消化液中 37℃水浴摇床消化 20min。

消化后组织悬液吹打打散，过 200 目筛网，收集细胞悬液。

三、细胞分离与消化

细胞悬液 700×g 离心 7min，弃上清，HBSS 重悬洗涤沉淀 2 次。

配制梯度液：底层铺 18% OptiPrep 分离液，上层缓慢铺细胞悬液，避免液面混合。

1800×g 4℃超速离心 17min，离心后分层，中层白膜层即为肝星状细胞富集层。

四、纯化与接种培养

小心吸取中间层细胞，加入 HBSS 稀释，600×g 离心 5min 洗去分离介质，重复洗涤 2 次。

完全培养基重悬计数，接种密度 2×10⁵个 /mL 接种培养瓶，37℃培养。

培养 24h 换液去除漂浮杂质；原代静息型 HSC 含脂滴呈透亮圆形，3~5 天自发活化呈肌成纤维样，每 2 天换液。