大鼠肝实质细胞

方法简介  实验室分离的大鼠肝实质细胞采用混合酶灌流消化、反复低速离心制备而来。

质量检测  实验室分离的大鼠肝实质细胞经Cytokeratin-18免疫荧光鉴定，纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

包被条件： 鼠尾胶原Ⅰ（2-5 μg/cm²）

培养基： 大鼠肝实质细胞完全培养基(基础培养基，含FBS、Insulin、Dexamethasone、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率： 每2-3天换液一次

生长特性： 贴壁

细胞形态： 上皮细胞样

传代比例： 不传代

传代特性： 不建议传代

消化液： 0.25%胰蛋白酶

大鼠肝实质细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

前置准备

实验动物：SD大鼠，取肝脏组织约2-3g

试剂：0.25%胰蛋白酶、II型胶原酶、DNase I、DMEM/F12培养基、胎牛血清(FBS)、PBS缓冲液、William E培养基/KSOM培养基、FBS、PBS、肝素

分离纯化步骤

取实验动物肝脏组织，通过门静脉灌注0.25%胰蛋白酶(37度、20分钟)

取出肝脏，剪碎后加入II型胶原酶37度振荡消化45-60分钟

消化液经70um和40um滤网过滤，100g离心5分钟收集肝细胞

采用Percoll不连续密度梯度离心(30%/60%)纯化肝细胞

原代培养要点

肝细胞：使用William E培养基+10%FBS+100nM地塞米松+10ug/mL胰岛素

肝细胞接种后4-6小时开始贴壁，24小时内形成典型多角形上皮样细胞

肝细胞培养3-7天后功能逐渐下降，建议实验在培养7天内完成

肝星状细胞：使用DMEM/F12+10%FBS培养，细胞呈成纤维细胞样生长

常见问题优化

肝细胞活力差：灌注压力控制在10-12mmHg，消化时间严格控制

肝细胞功能丧失：培养基中添加HGF(10ng/mL)和EGF(10ng/mL)可维持肝细胞功能

肝星状细胞活化：传代后细胞逐渐活化，建议冻存早期细胞

一、实验前准备

试剂配制

预灌液（无钙镁 HBSS+0.5mM EGTA+10mM HEPES，pH7.4，4℃预冷）；

胶原酶消化液（含钙镁 HBSS+0.05%Ⅳ 型胶原酶 + 10mM HEPES，现配 37℃预热）；

完全培养基：DMEM 高糖 + 10% 胎牛血清 + 1% 双抗 + 1mM L - 谷氨酰胺；

75% 医用酒精、PBS 缓冲液、台盼蓝染液。

器械与耗材 手术剪、弯镊、血管钳、留置针、蠕动泵、无菌培养皿、离心管、细胞筛（100 目 + 200 目）、培养瓶；器械高压灭菌烘干备用。

动物预处理 SD 大鼠（雄性 8~12 周）术前禁食 12~16h，自由饮水，减少肝内糖原，提升细胞活率；超净台紫外消毒 30min。

二、取材与预处理

大鼠腹腔注射 3% 戊巴比妥钠麻醉（50mg/kg），固定于解剖板，腹部体毛 75% 酒精充分消毒。

剪开腹腔暴露门静脉与下腔静脉，门静脉插管固定，剪断下腔静脉作为流出通道，立即开启蠕动泵灌注预灌液。

持续灌流至肝脏由暗红色完全褪成土黄色，停止预灌，更换胶原酶消化液循环灌流 8~12min，肝脏膨大发软、包膜起皱即可停止。

完整摘取肝脏置于无菌培养皿，小心剥离肝包膜与结缔组织，剪碎肝组织。

三、细胞分离与消化

剪碎肝组织加入少量预热胶原酶液，轻轻吹打 3~5min，松散组织团块。

混合悬液依次过 100 目、200 目无菌细胞筛，去除未消化组织残渣，收集滤液至 50mL 离心管。

4℃、50×g 低速离心 3min，弃上清（去除非实质细胞、碎片），沉淀用预冷无血清培养基重悬重复低速离心 2 次。

四、纯化与接种培养

沉淀用完全培养基重悬，台盼蓝计数，活细胞率＞85% 为合格。

接种密度 5×10⁵~1×10⁶个 /cm² 接种于胶原包被培养瓶 / 板，置于 37℃、5% CO₂培养箱。

接种 4h 后首次换液，去除未贴壁死细胞与杂细胞；后续每 24h 更换一次完全培养基，肝细胞可短期培养 3~7 天。