大鼠腹腔巨噬细胞

方法简介  实验室分离的大鼠腹腔巨噬细胞采用反复往腹腔注射培养基并抽取的方法结合差速贴壁制备而来。

质量检测  实验室分离的大鼠腹腔巨噬细胞经F4/80免疫荧光鉴定，纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

培养基： 大鼠腹腔巨噬细胞完全培养基(含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率： 每2-3天换液一次

生长特性： 贴壁

细胞形态： 巨噬细胞样

传代比例： 不传代

传代特性： 属于终末分化细胞；属于不增殖细胞群

消化液： 利多卡因（12 mM）

大鼠腹腔巨噬细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

前置准备

实验动物：SD大鼠，采集血液或提取组织免疫细胞

试剂：Ficoll密度梯度分离液、PBS缓冲液、DMEM/F12培养基、胎牛血清(FBS)、RPIM-1640或DMEM/F12培养基、胎牛血清(FBS)

分离纯化步骤

采集实验动物全血或获取组织悬液，用PBS稀释至适当体积

缓慢叠加于Ficoll密度梯度分离液上方，室温2000rpm离心20分钟

收集界面白色单个核细胞层，用PBS洗涤2次，300g离心8分钟

用含10%FBS的RPIM-1640完全培养基重悬细胞，计数并检测活力

可采用磁珠分选法进一步富集目标免疫细胞亚群(如CD11b+巨噬细胞、CD3+T细胞等)

原代培养要点

免疫细胞多为悬浮或弱贴壁生长，使用完全培养基RPIM-1640+10%FBS+1%双抗

37度、5% CO2培养，初始接种密度建议1x10^6 cells/mL

巨噬细胞培养可添加M-CSF(20ng/mL)促进增殖和维持表型

T细胞培养需添加IL-2(10ng/mL)和抗CD3/CD28抗体刺激增殖

常见问题优化

免疫细胞活力差：操作全程保持低温，避免反复离心和吹打

细胞凋亡：培养基中添加IL-4(20ng/mL)和IL-10(10ng/mL)可抑制巨噬细胞凋亡

纯度不够：采用MACS磁珠分选可获得纯度>95%的目标免疫细胞

一、实验前准备

无菌 PBS、注射器、离心管、RPMI1640 完全培养基，大鼠可提前 3d 腹腔注射淀粉肉汤诱导巨噬细胞增殖。

二、取材与预处理

大鼠脱颈处死，腹部消毒，剪开腹壁表皮，保留腹膜完整。

三、细胞分离与消化

腹腔注射 15mL 预冷无菌 PBS，反复揉捏腹腔 3~5min，吸出腹腔液体。

重复灌洗 2 遍，合并全部灌洗液，无酶消化。

静置去除少量组织碎屑。

四、纯化与接种培养

1000rpm 离心 5min，弃上清，培养基重悬细胞沉淀。

接种培养板，37℃孵育 2h，巨噬细胞贴壁牢固，弃上清去除悬浮淋巴细胞红细胞。

换液后即可用于后续实验，不宜长期传代。