大鼠肺微血管内皮细胞

方法简介  实验室分离的大鼠肺微血管内皮细胞采用组织贴块法并结合内皮细胞专用培养基培养筛选制备而来。

质量检测  实验室分离的大鼠肺微血管内皮细胞经CD31免疫荧光鉴定，纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

包被条件： PLL（0.1 mg/mL）或明胶（0.1%）

培养基： 大鼠肺微血管内皮细胞完全培养基(含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率： 每2-3天换液一次

生长特性： 贴壁

细胞形态： 内皮细胞样

传代比例： 1:2

传代特性： 可传2-3代

消化液： 0.25%胰蛋白酶

大鼠肺微血管内皮细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

前置准备

实验动物：SD大鼠，每只可获得2-5x10^5个内皮细胞，活力>85%

试剂：0.25%胰蛋白酶、II型胶原酶、DNase I、DMEM/F12培养基、胎牛血清(FBS)、PBS缓冲液、兔抗细胞CD31抗体(用于流式分选)、ECM基质胶

分离纯化步骤

取实验动物目标血管/组织，用预冷PBS冲洗去除血液，仔细分离去除外膜和脂肪组织

将组织剪碎后加入0.25%胰蛋白酶，37度消化15-20分钟，收集消化液

再加入II型胶原酶，37度振荡消化45-60分钟，充分分散组织

消化液经70um和40um滤网依次过滤，300g离心10分钟收集细胞

用含CD31抗体的磁珠进行阳性/阴性分选，或采用差速贴壁法去除成纤维细胞，收集CD31+内皮细胞

原代培养要点

将纯化后的内皮细胞接种于明胶预包被的培养皿中，使用ECM基质胶包被可显著提高贴壁率

接种密度建议3x10^4 cells/cm2，37度、5% CO2培养，内皮细胞通常24-72小时贴壁

使用内皮细胞专用培养基(含20%FBS、EGF 5ng/mL、FGF 2ng/mL、肝素10ug/mL)

每2-3天换液一次，细胞融合至80-90%时可用0.05%胰蛋白酶-EDTA传代

常见问题优化

内皮细胞被成纤维细胞污染：采用差速贴壁法2-3次，或CD31磁珠分选提高纯度

内皮细胞凋亡：培养基中添加ROCK抑制剂Y-27632(10uM)可显著提高存活率

表达内皮标志物下降：传代次数控制在3代以内，冻存早期细胞以备后续使用

一、实验前准备

1. 试剂：DMEM/F12 培养基、15% 胎牛血清、双抗、Ⅱ 型胶原酶、DNaseⅠ、无菌 PBS。

2. 器械：解剖套装、200/400 目细胞筛、离心管、培养瓶，超净台紫外灭菌。

3. 选用 4~6 周龄 SD 大鼠，术前器械高压灭菌。

二、取材与预处理

1. 大鼠麻醉处死后酒精消毒胸壁，开胸完整摘取双肺，PBS 反复冲洗肺组织至无血色。

2. 剔除气管、大支气管与肺门大血管，仅保留肺实质组织，剪碎为 1mm³ 组织糜，PBS 多次漂洗弃红细胞。

三、细胞分离与消化

1. 组织碎块加入含 DNaseⅠ 的 Ⅱ 型胶原酶消化液，37℃振荡消化 45min。

2. 培养基终止消化，双层筛网过滤收集单细胞悬液，离心弃上清。

3. PBS 重悬沉淀再次离心洗涤，去除消化酶与组织碎片。

四、纯化与接种培养

1. 细胞悬液接种培养瓶，差速贴壁 1h 去除成纤维细胞，转移上清至新培养瓶。

2. 培养 24h 首次换液，后续隔日换液，添加内皮生长添加剂提升细胞活性。

3. 细胞融合后消化传代，免疫组化 vWF 鉴定纯度，P1-P3 代用于实验。